5种常见腐乳微生物多样性的比较

习盈月,郭腾飞,亢文月,池毓烺，袁建军

(泉州师范学院 海洋与食品学院,福建 泉州 362000)

腐乳是我国传统的发酵型食品，它是以黄豆为原料，经过浸泡、磨细、制坯工序后，在适宜的环境条件下，经微生物发酵而成.其产地遍布全国各地，由于气候物产、风俗习惯、饮食爱好的差异，各地的腐乳各有其独特的风味.根据风味和色泽的不同，腐乳通常分为红方、白方、青方三大类；后来的新产品一般是在成熟的红方和白方腐乳基础上,添加某种经特殊处理的辅料所制得[1].

腐乳独特的风味是通过不同微生物分解植物蛋白、碳水化合物等成多肽、氨基酸及脂肪酸等风味前体物质[2]，再经后酵而形成.腐乳发酵通常可以分为自然发酵和纯种发酵.因此腐乳微生物的种类和丰度存在较大差异，而微生物的种类和数目对腐乳品质起着绝对性的作用[3].又因腐乳是半开放式生产且不能对腐乳进行高温灭菌[4]，因此环境微生物影响腐乳品质的同时也存在安全隐患，如发酵过程中生物胺[5-7]的生成.此外，微生物间的作用关系也值得关注，例如拮抗关系可能会抑制有害菌的生长从而降低腐乳的品质.因此，研究不同品牌腐乳微生物结构及多样性是非常重要的.

高通量基因测序技术是目前研究人员经常采用的研究传统发酵食品中的微生物多样性的技术手段之一，如运用于研究泡菜[8]、豆酱[9]、榨菜[10]、和豆豉[11]等传统发酵食品上，发现了更多的微生物类群，这些微生物是利用传统纯培养手段无法发现的[12].

因此，本研究采用高通量测序技术对市售不同产地、不同类别的5种不同品牌腐乳(红方2种，白方1种，新产品1种，牟定油腐乳1种)进行检测分析，旨在探究不同腐乳与菌落结构的关系，了解微生物在我国传统发酵食品的作用.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

在天猫超市(https://chaoshi.tmall.com/)购买不同产地、有代表性、销售量高、消费者评价较好的5种品牌腐乳，具体样品情况见表1.

表1 样品信息Tab.1 Sample information

试剂有PCR产物纯化试剂盒、TAE、DNA提取试剂盒、琼脂糖、引物、Tap PCR Master Mix.

1.2 仪器与设备

电子分析天平、实验室pH计，美国奥豪斯仪器(上海)有限公司；高压灭菌锅，广东圣托智能设备有限公司；生化培养箱、电泳仪，上海森信实验仪器有限公司；标准净化台，苏州智净净化设备有限公司；离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；PCR仪，杭州博日科技有限公司；Geldoc XR+型凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司.

1.3 方法

1.3.1 菌体的收集 采用洗脱法[13]收集G1-G5样品中的微生物，并且加以改进.在无菌操作台中，各取一整块腐乳和5 mL汤汁于研钵中，加入100 mL氯化钠质量浓度为8.5 g/L的生理盐水，用研杵对腐乳进行研磨搅拌，使G1-G5样品能够充分洗涤均质.将样品洗涤液倒入无菌离心管中在4 ℃、9 000 r/min离心10 min，然后去掉上清液，继续加入样品洗涤液，在4 ℃、5 000 r/min离心10 min,再重复以上操作(4 ℃、5 000 r/min离心10 min)3次，将沉淀置于-20 ℃冰箱保存备用.

1.3.2 腐乳微生物总DNA提取和菌株DNA提取 利用DNA提取试剂盒对G1-G5样品的总DNA进行提取.操作流程根据试剂盒说明书进行.提取完成的备用DNA装在DNA收集管中并储存于-20 ℃冰箱中.

1.3.3 PCR扩增和测序 针对G1-G5样品的DNA，使用通用引物338F(5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对细菌16S r DNA V3-V4区进行PCR扩增，同时利用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)对真菌ITS1区进行PCR扩增.用2%琼脂糖凝胶电泳检测，再用凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物.实验中，G2样品真菌PCR产物目的条带太弱，基因序列数目太少，无法进行下一步测序分析.

针对单菌落的DNA，利用引物1492R和27F对细菌进行16S r DNA PCR扩增，利用引物ITS1F和ITS2R对真菌ITS1区进行PCR扩增.

G1-G5样品PCR扩增产物由上海美吉生物医药科技有限公司进行Illumina Miseq测序，单菌株PCR扩增产物由厦门铂瑞生物科技公司测序.

1.3.4 生物信息学分析 (1) 数据信息管理.利用Trimmomatic软件对原始序列进行修剪和过滤[14]，然后去除含有N 碱基的序列，并且将每个序列的最小质量值设为20，再利用Flash软件把成对的双端序列拼接成1条序列.

(2) 物种注释与评估.利用Usearch(version 7.0)的软件平台，根据97%的相似性对优化后的序列进行OTU聚类分析.基于QIIME软件平台，运用RDP classifier贝叶斯算法，对OTU代表序列进行分类学分析[21]，并在门、纲、目、科、属、种分类学水平上统计各样品的群落组成结构.Qiime平台默认置信度阈值为0.7.计算菌群丰度的指数有Ace和Chao指数，Simpson和Shannon指数是计算菌群多样性，Coverage指数为测序深度指数(http：//www.mothur.org/wiki/)[23].然后再制作稀释性曲线进行分析.

(3) 物种分析.基于tax_summary_a文件夹中的数据表，利用R语言工具制作群落柱形图(Bar图)，分析样品群落组成.然后再制作层析聚类分析图，用于样品群落结构差异分析.

2 结果与分析

2.1 样品数据统计

通过高通量测序共获得372 591条序列，其平均读长323 bp，范围为146～420 bp.其中对细菌16S r DNA基因测序，5个样品共获得174 637条序列，平均长度约为415 bp.所有的序列均按照97%相似度归为OTU，共聚合了151个OTU.对真菌ITS1区进行测序，从4个样品中得到197 954条序列，平均长度约为193 bp，累计得到138个OTU[15].

2.2 Alpha多样性分析

Alpha多样性反映了某一群落的物种多样性及丰富度.腐乳样品中细菌和真菌的高通星测序数据见表2.在表2中，对于细菌，G1样品Chao指数和Ace指数显著高于其他4种样品，说明其物种总数最为丰富.G1样品的Simpson指数值最小，Shannon指数值最大，说明G1样品的群落多样性最高；反之G3样品的群落多样性最低.G1-G5样品的Coverage指数均大于0.99，说明这5种品牌腐乳中的序列被测出的概率高，能代表样品中微生物的真实情况.

在表2中，对于真菌，G4样品Chao指数和Ace指数显著高于其他3种品牌腐乳，说明其物种总数最为丰富.G4样品的Simpson指数值最小，Shannon指数值最大，说明了G4样品的群落多样性最高；反之G1样品群落多样性最低.G1、G3、G4、G5样品的Coverage指数均大于0.99，说明这4种品牌腐乳中的序列被测出的概率高，能代表样品中微生物的真实情况.

总体上，除G1样品外，G3、G4、G5样品都是细菌物种总数小于真菌物种总数；除G4样品外，G1、G3、G5样品的细菌群落多样性均大于真菌群落多样性.

表2 腐乳样品中细菌和真菌高通量测序数据汇总Tab.2 Summary of high-throughput sequencing data of bacteria and fungi in Sufu samples

2.3 稀释性曲线分析

对测序所得序列进行随机抽样，用抽到的序列数和它们所代表的各分类学水平数目构建稀释性曲线(图1-2).由图1(a)和图2(a)可知，G2-G5样品曲线趋于平坦，说明这4个腐乳样品测序数据量合理，测序量能够覆盖样品中的绝大部分物种.当G2-G5样品已经达到平台所达到的测序数目时，G1样品还没达到就已经停止,但此时G1样品的香农多样性曲线已趋于饱和，由此可知再增加测序量虽有新细菌种系会出现，但其多样性不会再发生变化，因而推测Sobs曲线随后也会达到平缓，能够反映样品中绝大多数微生物物种信息.因而本研究中各个样品的测序结果能够表达出样品中细菌微生物多样性，满足后续生物信息学分析需求.

由图1(b)和图2(b)可知，G1、G3、G4样品曲线趋于平坦，说明这3个腐乳样品测序数据量合理，测序量能够覆盖样品中的绝大部分物种.当G3、G4样品已经达到平台所达到的测序数目时，G5样品还没达到，再增加测序量OTU数量虽会增加，但其香农多样性曲线已趋于饱和.由此可知随测序量增加，尽管会出现新真菌种系型，但其多样性不会再发生变化，Sobs曲线也会达到平缓.因而本研究中各个样品的测序结果能够表达出真菌微生物多样性，满足后续生物信息学分析需求.

图1 细菌、真菌稀释曲线Fig.1 Rarefaction curves of bacteria,fungus

图2 细菌、真菌香农指数曲线Fig.2 Shannon curves of bacteria,fungus

2.4 微生物群落组成分析

G1-G5样品在属水平上细菌、真菌群落组成见图3.在细菌属水平上，图3(a)(others丰度<0.001)显示相对丰度前24的物种.G1-G5样品中的优势细菌属都为醋杆菌(Acetobacter)和乳酸杆菌(Lactobacillus)；共有细菌属为醋杆菌、乳酸杆菌、小球菌(Pediococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌(Oenococcus)、葡萄酸醋杆菌(Gluconacetobacter).其中，G1样品乳酸杆菌为第一优势菌属(35.47%)，G2-G5样品的第一优势菌属则是醋杆菌(57.14%、76.82%、64.30%、50.79%).G1样品所含菌属最多，其细菌物种种类比其他4种样品更为丰富，包含18个菌属；此外，肠杆菌也是其优势菌属，这与其他4个样品不同.G2-G5样品除了共有菌属之外，还均有未分类的乳杆菌科、双歧杆菌属，G2-G5样品细菌属水平上群落组成成分较为相似.

乳酸菌是发酵大豆食品中重要的天然菌群.乳酸菌通过发酵糖类产生乳酸等代谢产物，从而影响发酵产品的风味、色泽和品质,抑制腐败微生物,延长产品保质期[16].发酵豆制品中的乳酸菌分为嗜盐和耐盐两大类群，乳酸杆菌属耐盐类群[17].耐盐乳酸菌在腐乳的发酵过程中起促进风味物质和香气成分形成的作用[18].因此，推测G1样品与同为红方腐乳的G3样品的风味等品质差别可能是由于G1样品的第一优势菌属为乳酸杆菌导致.

在真菌属水平上，图3(b)(others丰度<0.01)显示相对丰度前13的物种.G1、G3、G4、G5样品中共有的真菌属分别为丝孢酵母、unclassified_f_Dipodascaceae、Cutaneotrichosporon属、毕赤酵母属、Wickerhamomyces属、假丝酵母、帚枝霉属.G1样品的绝对优势真菌属为曲霉菌(99.05%)，还含有少量的丝孢酵母和Wallemia菌属，其相对丰度分别为0.12%和0.02%.G3样品的绝对优势真菌属为unclassified_f_Dipodascaceae(93.01%)，还有少量的丝孢酵母(1.96%)和Cutaneotrichosporon属(1.37%).G4样品的优势真菌属为Cutaneotrichosporon属(39.06%)、毕赤酵母属(31.58%)、unclassified_f_Dipodascaceae(11.56%).G5样品的优势真菌属为丝孢酵母、伊萨酵母(Issatchenkia)、unclassified_f_Dipodascaceae;G5样品中除了图3中放射毛霉(Actinomucor)没有之外，还含有12个真菌属.可见在真菌属水平上，不同产品真菌物种组成差异明显.

图3 在属水平上细菌、真菌群落组成结构Fig.3 Composition and structure of bacterial , fungal community at genus level

G1-G5样品在种水平上细菌、真菌群落组成见图4.在细菌种水平上，由图4(a)(others丰度<0.001)可知，G1-G5样品中醋杆菌属和乳杆菌属都为优势菌属，但具体菌种种类和丰度随样品变化.其中绝对优势醋杆菌菌种都为罗旺醋杆菌(Acetobacter_lovaniensis)，在G1样品中该菌丰度最低，G3中丰度最高；另一种共有醋杆菌种为Acetobacter_indonesiensis，是G2样品的优势菌种.unclassified_g_Lactobacillus、 寡发酵乳杆菌(Lactobacillus_oligofermentans_DSM_ 15707_LMG_ 22743)、植物乳酸杆菌 (Lactobacillus_plantarum_g_Lactobacillus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、Lactobacillus_harbinensis为主要共有乳杆菌种；其中unclassified_g_Lactobacillus、寡发酵乳杆菌为乳杆菌种中相对优势菌种，除G1样品中unclassified_g_Lactobacillus相对丰度大于寡发酵乳杆菌，为G1样品优势菌种，G2-G5样品则反之.仅G1样品中存在unclassified_g_Enterobacter，且为其优势菌种.总体来说，细菌种水平下，不同类型的5种品牌腐乳中细菌群落主要菌种组成类似，组成比例存在一定差异；但G1样品不仅与不同类型白方腐乳区别明显，与同为红方腐乳的G3样品亦是，且其拥有菌种种类最多.

在真菌种水平上，由图4(b)(others丰度<0.001)可知，4个样品的菌种组成和优势菌种区别十分明显.Aspergillus_minisclerotigenes是G1样品中的绝对优势菌种，其相对丰度高达99.03%.unclassified_f_Dipodascaceae(耶罗威亚酵母科)是G3样品绝对优势菌种，其相对丰度为93.01%，此外还存在同属的Dipodascaceac_sp菌种；这两种菌种也存在于除G1样品外的其他样品中.发酵毕赤酵母(Pichia_fermentans)、Cutaneotrichosporon_curvatus、Cutaneotrichosporon_jirovecii是G4样品中的优势菌种，且前两种除G4样品外仅G3样品中少许存，后一种仅存在于G4样品，G4样品菌种组成最丰富.未分类g丝孢酵母(unclassified_g_Trichosporon)和伊萨酵母(Issatchenkia)是G5样品中的优势菌种，伊萨酵母仅存在于G5样品.可见不同品牌腐乳中真菌主要优势菌种、物种组成和相对丰度都差异较大；且与腐乳类型无关.

图4 在种水平上细菌、真菌群落组成分布Fig.4 Distribution of bacterial,fungus communities at species level

G1、G3样品同为红方腐乳，风味色泽却差异明显.检测发现G1样品中细菌物种总数最丰富，第一优势菌属为乳酸杆菌且含有最多种类的乳酸杆菌，群落多样性最高；真菌物种总数最少，群落多样性最低，绝对优势真菌为曲霉.G3样品中细菌物种总数和群落多样性都最低，第一优势菌属为醋酸杆菌且乳酸杆菌含量最低；真菌物种总数较G1样品多，绝对优势真菌属为酵母与G1样品不同.原因可能是G1样品在生产中加入玫瑰花作为辅料，玫瑰花中的微生物在后发酵过程中影响了该样品的菌群结构.在发酵过程中，不同乳酸菌的代谢途径不同，导致产品中糖和氨基酸的组成不同，影响产品风味以及美拉德反应的方式和程度进而影响产品色泽[19].G1样品和G3样品真菌种类少于G4样品和G5样品，可能是由于乳酸菌和醋酸菌产生的乳酸、乙酸等产物抑制了这两种样品中含有的大多真菌生长.

G4样品属于腐乳新产品，是在白方腐乳基础上加工而成.G5样品为牟定油腐乳，是一种独特的腐乳品类，其生产工艺与白方腐乳相近.在细菌属水平上，G4、G5样品优势菌属与G2样品(白方腐乳)相同；但G2样品优势醋酸杆菌菌种有2种，与G4、G5样品不同.在真菌属和种水平，G4样品OTU数和群落多样性最高；G4、G5样品以及红方G3样品的优势真菌虽都为酵母，但菌种不同.不同的优势细菌和真菌菌种可能是造成G4、G5产品品质差异的原因.白方腐乳和红方腐乳在加工工艺及原料上都存在区别.几乎所有白方腐乳在制作过程中不添加糖，仅靠酒精和盐对微生物活动造成主要影响;而红方腐乳则是会添加糖,同时食盐添加量小于白方腐乳.参考醋的发酵周期，在发酵初期，淀粉糖化主要依靠曲霉代谢作用完成，酵母菌等其他菌属则协同曲霉代谢将淀粉降解为小分子糖，为后续的反应提供底物[20].在发酵过程中，乳酸菌能产生乳酸、氨基酸和其他风味化合物；酵母菌可产生乙醇，促进有机酸、吡嗪类和酯类等风味物质的生成；醋杆菌属能氧化乙醇、糖醇等生成乙酸、乳酸等有机酸，还能促进一些酮类和醛类风味物质的生成[21].

值得注意的是，乳酸杆菌属为G1-G5样品中的优势菌，在G1样品中还检测到少量的假单胞菌属.乳酸杆菌属和假单胞菌属都能产生脱羧酶，可能会使腐乳中的游离氨基酸发生脱羧反应生成生物胺而影响腐乳品质，生物胺的生成量在生产过程中是需要被控制的.同时，G1样品中含有相对丰度为19.59%的肠杆菌属和3.90%假单胞菌，G2和G4样品中也存在少量的肠杆菌属，而肠杆菌和假单胞菌被证实会导致食品污染和腐败[22].为确保食品安全，在腐乳发酵过程中预防这些不良微生物是至关重要的.

2.5 层析聚类分析

树枝间的长度代表样本间的距离,细菌、真菌属水平上层析聚类分析见图5.

图5 细菌、真菌属水平上层析聚类分析图Fig.5 Chromatographic cluster analysis diagram at the level of bacteria genus,fungus genus

如图5(a)所示，在细菌属水平上，5个样品中G2和G4群落结构较为相似，而G1样品和其他样品群落结构差异较大.如图5(b)所示，在真菌属水平上，4个样品中G3和G4样品群落结构较为相似，而G1样品和其他样品群落结构差异较大.

总结发现，G1样品和其他样品在微生物群落结构上差异较大，且各样品在细菌属水平上的菌群结构差异较真菌属水平大.G1样品与其他样品存在明显品质差异,可能是由于其细菌菌群结构与其他样品差异明显导致.

3 结论

采用高通量测序技术，对比分析5种样品腐乳的群落结构及多样性.结果表明，腐乳微生物多样性与其类型并无太大关系，不同样品的微生物多样性不同，同类型腐乳之间微生物多样性也差异较大；且不同样品间的细菌群落组成差异比真菌群落组成差异更为明显.其中，G1样品(王致和玫瑰腐乳)拥有最多的细菌种类数，细菌群落多样性最高,在真菌属和细菌属水平上的群落结构明显与其他样品差异明显.G4样品(老干妈红油腐乳)拥有最多的真菌种类数，真菌群落多样性最高；在细菌属水平上,群落结构与G2样品(玛瑙泉麻油白腐乳)最为相似；在真菌属水平上,群落结构与G3样品(咸亨香酥红方腐乳)最为相似.

细菌属水平，醋杆菌和乳酸杆菌为G1-G5样品的优势菌属；但G1样品是乳酸杆菌为第一优势菌，G2-G5样品则是醋杆菌为第一优势菌属；此外，肠杆菌为G1样品独有优势菌属.细菌种水平，罗旺醋杆菌和Acetobacter_indonesiensis为主要醋杆菌种；其中罗旺醋杆菌是所有样品的绝对优势菌种，但在G1样品中丰度最低，G3样品中丰度最高；Acetobacter_indonesiensis在G2样品丰度最高.unclassified_g_Lactobacillus、 寡发酵乳杆菌为主要乳杆菌种；其中unclassified_g_Lactobacillus在G1样品中丰度最高，且仅G1样品中丰度高于寡发酵乳杆菌.unclassified_g_Enterobacter为G1样品独有优势菌种.真菌属和种水平上，样品差异类似，4个样品的菌种组成和优势菌种区别十分明显.G1样品中Aspergillus_minisclerotigenes是绝对优势菌种.G3样品中unclassified_f_Dipodascaceae是绝对优势菌种.G4样品中发酵毕赤酵母、Cutaneotrichosporon_curvatus、Cutaneotrichosporon_jirovecii是主要优势菌种，Cutaneotrichosporon_jirovecii仅存在于G4样品.G5样品中未分类g丝孢酵母和伊萨酵母是主要优势菌种，伊萨酵母仅存在于G5样品中.

相比于本研究中的其他样品，G1样品(王致和玫瑰腐乳)由于原料中玫瑰花的加入而形成的独特的微生物多样性可能是造成其风味、色泽等品质区别于其他产品的主要原因.

对腐乳微生物多样性的研究，将为制造商和研究人员更进一步解析腐乳发酵过程，控制腐乳产品性质以及设计开发混合菌种发酵剂等提供参考.