二甲双胍通过抑制NLRP1等炎症小体改善小鼠卵巢储备的作用

王维贵，郭路，刘晓程，顾超，李斌

1.复旦大学附属妇产科医院妇科，上海 200011；2.上海市女性生殖内分泌相关疾病重点实验室，上海 200090；3.复旦大学上海医学院，上海 200032

随着人口老龄化的加剧，对衰老的研究越来越受到社会的关注。现有研究发现，衰老与炎症相关，在衰老过程中，组织和器官在机体中经历一种慢性的和进行性的促炎状态，长期慢性炎症可以诱导卵巢功能减退，引发过早绝经，导致早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）［1-2］。POI 是女性在40 岁之前卵巢功能衰退并逐渐丧失的现象，其特征是出现原发性闭经，或卵巢的原始卵泡过早耗竭导致的继发性闭经。POI 的发病率约1%，近年来又升高趋势，严重影响女性生殖健康［3］。POI 的病因和发病机制错综复杂，约50%以上的患者病因不明［4］。氧化应激影响卵泡生成、生长及成熟过程，在卵巢衰老过程中具有重要的作用［5］。氧化应激是激活炎症小体活化的主要途径之一，氧化应激可通过激活NLRP1 参与多种神经系统疾病和自身免疫性疾病的发病过程［6］。抗氧化剂已被成功应用于减少氧化应激损伤［7］。二甲双胍（Metformin，Met）具有抗氧化能力，可改善卵巢功能［8-10］。此外，二甲双胍还可以通过抑制NLRP炎症小体途径保护细胞功能，但NLRP1 炎症小体在二甲双胍改善卵巢储备中的作用及机制尚不清楚［11］。因此，本研究拟在建立雷公藤多苷（Tripterygium glycosides，TG）诱导的氧化应激损伤POI 小鼠模型的基础上，探讨二甲双胍对卵巢储备作用，并进一步探索NLRP1 等炎症小体信号通路参与其作用的机制，以明确二甲双胍的抗氧化应激作用，并为深入研究POI 的潜在治疗靶点提供新思路。

1 材料与方法

1．1 POI 小鼠模型建立

选取20 只SPF 级6 周龄雌性C57BL／6 小鼠（购自上海斯莱克实验动物有限责任公司），均经阴道涂片筛查，动情周期正常，适应性喂养1 周，采用数字表法随机分为实验组与对照组，每组10 只。实验组予50 mg／kg／d TG（湖北黄石飞云制药有限公司）连续皮下注射35 d，对照组注射等量生理盐水［12］。

1．2 动物实验分组及取材

选取40 只SPF 级6 周龄雌性C57BL／6 小鼠，均经阴道涂片筛查，动情周期正常，适应性喂养1 周，随机分为TG 组、TG ＋Met 组、Met 组与对照组，每组10只。实验组采用二甲双胍（购自北京京丰制药集团有限公司）进行干预，并随机分为：TG 组，予50 mg／kg／d TG 连续皮下注射及生理盐水灌胃35 d；TG ＋Met 组，予TG 50 mg／kg／d 皮下注射及Met 100 mg／kg／d 灌胃35 d；Met 组，予生理盐水皮下注射及Met 100 mg／kg／d灌胃35 d。对照组予生理盐水皮下注射及灌胃35 d。每日9 点行阴道脱落细胞涂片［13］；每周称量体质重；上述处理后取材，称定质重，计算卵巢指数（其中卵巢湿重单位为mg，体质量单位为g，卵巢指数单位均为mg／g）［14］；10%甲醛溶液固定卵巢24 h，石蜡包埋，常规切片，HE 染色后对原始卵泡、窦前卵泡、窦状卵泡、成熟卵泡、黄体及闭锁卵泡进行计数［15］。

1．3 酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

全血收集后于4 ℃离心10 min，收集上清液，按照试剂盒说明书测定血清促卵泡生成素（Follicle-stimulating hormone，FSH）、雌二醇（Estrogen，E2）、抗苗勒管激素（anti-Mullerian hormone，AMH）、IL-1β 及IL-18 的水平。上述试剂盒均购自武汉华美生物工程有限公司。

1．4 微板法检测血清氧化应激指标

收集全血，4 ℃离心10 min，收集上清液，按照试剂盒说明书测定血清丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）的水平变化。上述试剂盒均购自武汉华美生物工程有限公司。

1．5 蛋白质免疫印迹（Western blot，WB）

制备蛋白样品，BCA 检测蛋白浓度，30 μg 蛋白样品上样，60 V 电压跑浓缩胶，120 V 分离胶电泳。330 mA 恒电流转膜90 min，冰水混合物降温。牛奶封闭60 min，一抗稀释液NLRP1（1∶2 000，Abcam）、NLRP3（1∶2 000，Abcam）、NF-κB（1∶2 000，Abcam）、NLRP12（1∶2 000，Thermo Scientific）、IL-1β（1∶2 000，Abcam）、IL-18（1∶2 000，Abcam），4 ℃孵育过夜。第2 天室温摇床孵育二抗60 min，应用ECL 超敏发光液试剂盒配置发光液，放入发光仪曝光条带，测定各显色条带的灰度值，以目的蛋白／内参蛋白的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1．6 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0 软件分析数据。所有数据以均数±标准差（±s）表示，2 组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2．结果

2．1 氧化应激损伤POI 小鼠模型建立

TG 模型组小鼠动情周期紊乱，平均动情间期延长，平均动情期缩短；此外，TG 模型组小鼠卵巢指数下降；原始卵泡、窦前卵泡、窦状卵泡、成熟卵泡和黄体数量明显减少，闭锁卵泡数量显著增加；血清FSH 升高，E2和AMH 降低。以上结果提示，TG 可成功诱导建立POI 小鼠模型。TG 模型组血清抗氧化指标SOD、CAT 和GSH-Px 活性下降，氧化指标MDA 活性升高，提示氧化应激可能参与POI 发生。见图1 ～3。

图1 小鼠阴道脱落细胞涂片（ ×200）

图2 TG 诱导氧化应激损伤POI 小鼠模型

图3 POI 模型小鼠氧化应激水平改变

2．2 二甲双胍可改善小鼠卵巢功能

与TG 模型组相比，TG ＋Met 组小鼠平均动情间期缩短，平均动情期延长，卵巢指数上升，原始卵泡、窦前卵泡、窦状卵泡、成熟卵泡和黄体数量上升，闭锁卵泡数量下降，血清FSH 水平下降，AMH 和E2水平升高。表明二甲双胍具有改善氧化应激损伤POI 模型小鼠卵巢储备功能。见图4～5。

图4 各组小鼠卵巢组织HE 染色图片（ ×40）

图5 二甲双胍对POI 小鼠卵巢作用

2．3 二甲双胍具有抗氧化应激作用

与模型组比较，TG ＋Met 组小鼠血清SOD、CAT、GSH-Px 活性升高，MDA 活性下降，提示二甲双胍可改善小鼠血清氧化应激水平。见图6。

图6 二甲双胍对POI 小鼠血清氧化应激水平的影响

2．4 NLRP1 等炎症小体可能参与二甲双胍抗氧化改善小鼠卵巢储备过程

TG 模型组卵巢组织NLRP1 复合物、NLRP3、NF-κB、IL-1β 及IL-18 均高表达，NLRP12 低表达，TG ＋Met 组卵巢组织NLRP1 复合物、NLRP3、NFκB、IL-1β 及IL-18 表达下调，NLRP12 表 达上调，这与小鼠血清IL-1β 及IL-18 的变化相一致。以上结果表明，NLRP1 等炎症小体信号通路可能参与二甲双胍改善氧化应激损伤POI 小鼠卵巢功能过程，NLRP12 在小鼠体内可能具有保护作用。见图7 ～8。

图7 二甲双胍对小鼠卵巢组织NLRP1 等炎症小体作用

3 讨论

POI 的病理生理机制错综复杂，遗传、医源性、免疫、环境等多种因素参与其发生发展［16］。近年来研究发现，在POI 动物模型中，过氧化产物MDA 活性升高，抗氧化物SOD、CAT、GSH-Px 活性下降，表明氧化应激与POI 的发生发展密切相关［17］。此外，POI 患者血清FSH 与总抗氧化应激量（TAS）呈负相关，与总氧化应激量（TOS）、氧化应激指数呈正相关［18］。然而氧化应激在POI 中作用机制尚不明确，H2O2常被用于建立氧化应激损伤细胞模型，但是由于H2O2稳定性差，在动物实验中研究受限。现已经报道的POI 模型包括基因敲除模型、酶缺陷模型、免疫缺陷模型、化疗药物模型、放射线模型、药物毒性作用模型等［19］。本课题在既往研究的基础上，采用TG 诱导氧化应激损伤POI 小鼠模型并对其验证［12］。

抗氧化剂通过减少或直接清除体内产生的自由基，增强机体的抗氧化能力，在POI 疾病治疗中具有广泛的应用前景。既往研究发现抗氧化剂褪黑素可通过激活PI3K-Akt 轴抑制FOXO1 减缓颗粒细胞氧化损伤，白藜芦醇可以通过降低ROS 水平增加抗氧化基因的表达，其抗凋亡作用可对抗衰老卵母细胞线粒体膜电位下降［20-21］。二甲双胍是双胍类降糖药，被广泛用于2 型糖尿病治疗，能调节血糖、血浆内胰岛素、脂蛋白水平进而预防高脂血症等并发症，其可通过激活AMPK 通路，抑制下游mTORC1 及降低线粒体ROS 产生减少氧化应激损伤和免疫应答［22］。在心肌细胞中，二甲双胍通过激活AMPK 通路改善H2O2诱导的氧化应激损伤［23］。在年龄相关性白内障中，二甲双胍可通过激活AMPK 缓解氧化应激诱导的HLE-B3 细胞衰老［24］。在多囊卵巢综合征患者中POI 发生率显著升高，应用二甲双胍患者POI 发病率降低，表明二甲双胍的使用可以降低POI的发生风险［10］。然而目前研究尚未揭示二甲双胍与POI 的关系及作用机制。因此本实验选择二甲双胍对POI 小鼠模型进行干预，结果发现二甲双胍可改善POI 模型小鼠氧化应激水平，并且与POI 模型组相比，二甲双胍联合用药组小鼠平均动情间期缩短，平均动情期延长，卵巢指数上升，原始卵泡、窦前卵泡、窦状卵泡、黄体数量上升，闭锁卵泡数量下降，FSH 水平下降，AMH 和E2升高。表明二甲双胍可通过抗氧化作用改善小鼠卵巢功能。

NLRP 炎症小体是一类通过NOD 样受体（NODlike receptors，NLRP）传递细胞内危险信号的多蛋白复合物，由模式识别受体（Pattern recognition receptors，PRRs）、细胞凋亡相关的斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）和caspase-1 构成，NLRP通常作为一种防御性机制激活，但当机体受到各种内源性和外源性因素被过度刺激时，模式识别受体招募并结合下游的ASC 及caspase-1 或激活NF-κB 信号通路介导产生IL-1β 和IL-18 炎性因子，引起炎症持续发生可引起组织损伤及器官功能紊乱，从而导致多种疾病的发生［25］。目前发现的炎症小体主要包括NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRP6、NLRP7、NLRP12、AIM2、Pyrin和NLRC4 炎症小体等［6］。NLRP1 炎症小体是第一个被鉴定的，它是由NLRP1、caspase-1 和ASC 构成，激活可引起下游的炎症级联反应，近年来研究表明，氧化应激可激活NLRP1 炎症小体参与了多种神经系统疾病和自身免疫性疾病的发病过程，但在POI 中未有报道［26］。NLRP3 可增加衰老卵巢中的自噬作用，通过改善自噬延缓衰老和卵巢寿命，且整个卵泡发育过程中NLRP3 蛋白在卵母细胞和颗粒细胞中的定位与炎症蛋白的定位是一致的［27］。NLRP12 可通过负向调节NF-κB 信号通路抑制炎症发生［28］。在本次研究中，课题组发现在雷公藤多苷建立小鼠POI 模型中NLRP1 炎性小体复合物、NLRP3、NFκB、IL-1β 及IL-18 均提示高表达，血清氧化应激水平升高，二甲双胍干预保护后NLRP1 炎性小体复合物、NLRP3、NF-κB、IL-1β 及IL-18 表达下调，血清氧化应激水平降低，表明二甲双胍可通过降低氧化应激水平抑制NLRP1 等炎症小体，进而抑制炎症因子的释放，从而改善卵巢功能。

综上所述，二甲双胍具有抗氧化应激作用，其机制可能是通过抑制NLRP1、NLRP3 等炎症小体复合物，减少炎症因子的产生进而改善POI 表型，本研究有助于寻找POI 治疗潜在靶点。但是本实验存在一定的局限性，首先，氧化应激在激活NLRP1 的同时，NLRP3 也参与其调控，两者是否具有协同作用有待进一步阐明；其次，本研究是采用二甲双胍保护性干预TG 诱导的POI 动物模型，尽管多项研究提示二甲双胍具有抗氧化应激作用，但后续实验中可增加NLRP1的抑制剂或采用NLRP1 基因敲除鼠需进一步研究；最后，本文机制研究较浅，氧化应激与炎症小体及炎性因子之间信号通路较为复杂，具体调控机制尚不清楚，仍需后续的实验研究进一步探索。