安徽某猪场猪链球菌9型的分离与鉴定

唐正露，王嘉珍，陈阳露，李 郁

（安徽农业大学动物科技学院，安徽 合肥 230036）

猪链球菌（Streptococcus suis, SS）是世界范围内引起猪链球菌病的最主要病原菌，可导致猪脑膜炎、心内膜炎、多发性浆膜炎、关节炎和败血症，还易与其他病原体造成混合感染[1]。根据荚膜多糖抗原性的不同，SS可分为35个血清型（1～34及1/2型），其中1/2、1、2、7、9和14型SS具有人畜共患性，以2型最为常见、致病力最强。在我国目前尚未见到SS9感染人的报道，但近年来SS9在兽医临床上的分离率逐渐上升且有扩大流行的趋势。

2021年9—10月，安徽某猪场35～40日龄的断奶仔猪临床表现发热、呼吸困难、神经症状，甚至急性死亡。本研究对送检的发病猪病料进行细菌分离与鉴定，确定该场存在SS9感染，应用多位点序列分型（multilocus sequence typing, MLST）和PCR方法测定分离到的6株SS9的ST型和毒力基因型，同时构建系统发育树以明确各分离菌株间的亲缘关系及进化情况，从而为该场有效防控猪链球菌病提供依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

病料为安徽某猪场送检的6份疑似发生猪链球菌病的35～40日龄断奶仔猪脑部。

1.2 主要试剂及培养基

2×Taq Mix Pro（+Dye）、DL 2 000 DNA Marker购自莫纳（武汉）生物科技有限公司；胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA-YE）、胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤（TSB-YE）购自杭州微生物试剂有限公司；小牛血清购自上海羽哚生物科技有限公司；无菌脱纤维兔血购自南京茂捷微生物科技有限公司；革兰氏染液购自南京建成生物工程研究所。

1.3 细菌分离培养与形态学观察

无菌采集6份发病猪脑组织分别接种于含5%小牛血清的TSA-YE培养基和含5%兔血的TSA-YE培养基，采用需氧、微需氧、厌氧3种培养方式，置于37 ℃培养12～18 h，观察细菌的生长情况，并挑取单个可疑菌落进行革兰氏染色，镜检，观察其形态特征。

1.4 引物合成

参考文献[2-3]设计SS gdh基因、SS9分型基因cps9J、毒力基因（mrp、epf、sly、orf2、fbps、gapdh）和管家基因（aroA、cpn60、dpr、gki、mutS、recA、thrA）引物，均由通用生物系统（安徽）有限公司合成，引物序列见表1。

表1 SSgdh基因、cps9J基因、毒力基因和管家基因引物信息

1.5 分离菌株的PCR鉴定

煮沸法提取6株分离菌基因组DNA作为模板，扩增SS gdh基因。PCR反应体系（25 μL）：2×Taq Mix Pro（+Dye） 12.5 μL，ddH2O 6.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板5 μL。PCR反应条件：94 ℃、5 min；94 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、1 min，35个循环；72 ℃、7 min。

1.6 SS血清型的PCR鉴定

煮沸法提取DNA模板，扩增cps9J基因。PCR反应体系（25 μL）：2×Taq Mix Pro（+Dye）12.5 μL，ddH2O 5.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板5 μL。PCR反应条件：95 ℃、15 min；94 ℃、30 s，58 ℃、90 s，72 ℃、1 min，30个循环；72 ℃、10 min。

1.7 SS毒力基因型PCR鉴定

煮沸法提取DNA模板，扩增6株SS9的毒力基因mrp、epf、sly、orf2、fbps和gapdh。PCR反应体系同1.5。PCR反应条件：95 ℃、5 min；94 ℃、1 min，56 ℃、45 s，72 ℃、1 min，35个循环；72 ℃、10 min。

1.8 SS MLST鉴定及分析

1.8.1 6株SS9的ST型鉴定 参照安徽省地方标准DB 34/T 3488—2019鉴定SS MLST[4]，对6株SS9的7个管家基因进行扩增，扩增产物由通用生物系统（安徽）有限公司进行双向测序。将测序结果上传至SS MLST数据库（http://ssuis.mlst.net）进行分析比对，获得菌株相应管家基因等位基因编号，确定相应ST型。PCR反应体系同1.5。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，退火（退火温度见表1）30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。

1.8.2 系统发育树的构建 利用Editseq软件对1.8.1中测序结果进行序列的拼接比对，对齐序列利用MEGA 7软件构建6株SS9分离株和7株SS9参考菌株[5-6]的ST型系统进化树进行聚类分析。7株SS9参考菌株信息见表2。

表2 7株SS9参考菌株信息

2 结果

2.1 细菌分离培养及形态学观察结果

从6份病料中共分离到6株细菌，分别命名为A～F。分离株在含5%小牛血清的TSA-YE均呈灰白色半透明、表面光滑、边缘整齐针尖状菌落；在含5%兔血的TSA-YE培养基均呈灰白色、表面光滑、边缘整齐小菌落，β溶血（厌氧培养时不溶血）；且在需氧、厌氧环境中培养时，细菌生长速度较微需氧培养时快；革兰氏染色后镜检，分离株均为革兰氏阳性菌，呈球形或卵圆形，链状排列，符合SS的培养及形态学特性（图1）。

图1 分离株培养特性及形态学特性

2.2 分离菌株PCR鉴定结果

A～F分离株均扩增出SS gdh基因（688 bp），表明A～F分离株均为SS（图2）。

图2 A～F分离株SS的PCR鉴定结果

2.3 SS血清型PCR鉴定结果

A～F SS分离株均扩增出cps9J基因（368 bp），表明A～F SS分离株均为SS9（图3）。

图3 6株SS分离株血清9型的PCR鉴定结果

2.4 SS毒力基因型PCR鉴定结果

6株SS9有3种毒力基因型，其中A、D分离株的毒力基因型相同，为epf-mrp+sly+gapdh+fbps+orf2-；B、C分离株的毒力基因型相同，为epf-mrp+slygapdh+fbps+orf2-；E、F分离株的毒力基因型相同，为epf-mrp+sly+gapdh+fbps+orf2+（图4）。

图4 6株SS9毒力基因PCR鉴定结果

2.5 SS MLST鉴定及分析结果

2.5.1 SS MLST鉴定结果 利用特异性引物对6株SS9的7个管家基因进行扩增，将扩增片段的测序结果上传至SS MLST数据库（http://ssuis.mlst.net），得到13个等位基因，经组合共获得两种ST型，其中A、D、E、F分离株ST型相同，为ST1330；B、C分离株ST型相同，为ST243。6株SS9的MLST鉴定结果见表3。

表3 6株SS9的MLST鉴定结果

2.5.2 系统发育树的构建 利用MEGA 7软件对6株SS9分离株和7株SS9参考菌株的ST型构建系统发育树。13株SS9共7种ST型，分为2个大分支，分支1包括ST1330、ST125和ST243，分支2包括ST613、ST790、ST730和ST16。本研究6株SS9分离株同处于分支1上，其中A、D、E、F分离株与B、C分离株分别位于同一进化分支的2个水平；A、D、E、F分离株与参考菌株74602（西班牙）亲缘关系较近，而B、C分离株与参考菌株1454（中国江苏）、65（中国广州）亲缘关系较近（图5）。

图5 SS9分离株和参考菌株ST型系统发育树

3 讨论

猪链球菌病在我国被划分为二类动物疫病，病猪因年龄、SS血清型的不同临床表现各异，其中超急性和急性感染病例发病急、死亡快，给养猪业造成重大经济损失。自1991年我国首次报道该病以来，SS的分离率逐年递增，以SS2、SS9两种血清型居多，且近年来SS9分布越来越广泛，流行趋势不断扩大。徐引弟等[7]对河南省2016年5月至2017年5月分离的189株SS临床分离株进行血清型鉴定，SS9的分离率为12.7%（24/189）；石大丽等[8]从2018年1—6月广西部分地区采集的病料中分离出32株SS，其中SS9 为14株，分离率43.75%。本研究对某猪场送检的疑似SS感染的病猪病料进行细菌分离鉴定，获得的6株SS均为SS9，分离率高达100%。

研究表明，即使是同一血清型的SS分离株，其毒力也在不断变化[9]。目前，已知的SS毒力因子大约有61种，分为4大类：表面因子类、酶类、转录或调节因子类及其他类[8]。本研究测定了溶菌酶释放蛋白（mrp）、胞外因子（epf）、溶血素（sly）、毒力相关序列（orf2）、纤连蛋白原结合蛋白（fbps）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gapdh）6种毒力因子在6株SS9分离株中的分布情况，结果共呈现3种毒力基因型，A、D分离株为epf-mrp+sly+gapdh+fbps+orf 2-，B、C分离株为epf-mrp+sly-gapdh+fbps+orf 2-，E、F分离株为epf-mrp+sly+gapdh+fbps+orf 2+，其中epf、gapdh、fbps的检出情况（epfgapdh+fbps+）与国内已报道SS9毒力基因检出情况基本一致[2，8，10，11]。Fittipaldi等[12]认为mrp、epf、sly基因与SS的毒力呈正相关，而周俊明等[11]发现部分毒力基因缺失的2株SS9江苏分离株（mrpepf-sly-orf 2+sao-fbps+gdh+）对小鼠致病力明显强于2株SS2江苏分离株（mrp+epf+sly+orf 2+s ao+fbps+gdh+），推测SS9可能存在某些特定的影响致病力强弱的毒力基因尚未被发现，故本研究6株SS9的毒力强弱需结合后续小鼠致病性试验结果进行判断。

SS的多位点序列分型（MLST）方法是基于SS基因组中7个管家基因在菌株中的多态性建立的，可用于区分SS的基因型并跟踪SS潜在流行菌株。SS9菌株具有高度多样化，不仅在整体水平上表现出遗传多样化，而且在进化关系相近的基因型间也表现为毒力基因型的多样化。Dong等[9]研究了30株SS9分离株（24株中国分离株、5株越南分离株和1株丹麦分离株）ST型与毒力的关系，发现系统发育相关性会导致SS9菌株存在相似的毒力基因型，但即使是同一ST型也会表现出毒力多样性，其中ST243被认为是SS9中具有高毒力潜力的ST型。本研究6株SS9共分为2个ST型，A、D、E、F分离株为ST1330，与西班牙分离株74602亲缘关系较近；B、C分离株为ST243，与江苏分离株1454和广州分离株65亲缘关系较近；其中A、D分离株，E、F分离株，B、C分离株毒力基因型分别一致，说明同一ST型的SS9菌株毒力基因型不同，与上述结论一致，同时应注意B、C分离株（均为ST243）可能为高毒力菌株。