磁性纳米颗粒在环境中类固醇激素检测的应用与研究进展

刘宇尘，周剑*，王敏*

1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全重点实验室（北京 100081）；2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全重点实验室（北京 100081）

类固醇激素（steroid hormones，SHs）是一类脂溶性，低分子量的具有内分泌干扰作用的四环脂肪烃化合物[1]。其分为人工及化学合成两大类，常应用于畜牧业和集中养殖过程中作为避孕药、动物生长调节剂及农业肥料，主要通过动物排泄过程进入环境[2]。进入环境后类固醇激素的降解困难，其对水、土壤、沉积物和其他环境介质的污染逐渐成为新的健康问题。同时也可能随着食物链流入人体内，人体过量摄入SHs会产生多种内分泌危害，如改变荷尔蒙水平，扰乱生物体的体内稳态系统，增加人类罹患心血管疾病，前列腺癌和乳腺癌等风险，并且可能诱发男性生殖系统疾病，胎儿畸形和女性化等危害[2-3]。内分泌疾病的发病期十分广泛，从出生至死亡，且在不同时期甚至同一时期会出现患有多种内分泌疾病的情况。类固醇激素微小的化学结构差异造就截然不同的功能特性，在环境中含量较低属于痕量存在，且不同类固醇激素之间的合成转化途径复杂，使得准确检测既十分必要也十分困难[4]。因此选择合适，灵敏准确的检测方法成为检测的重中之重。传统前处理技术有固相萃取（SPE），液液萃取（LLE），固相微萃取（SPME）等，广泛应用于类固醇激素的富集和提取，但存在耗时长、操作繁琐、吸附剂用量高的弊端。因此，开发简便、高效的前处理方法成为近些年研究热点[3,5]。

磁性纳米材料的兴起为萃取吸附剂的选择提供更为广阔的思路。根据其独特的超顺磁性特点，可在外部磁场作用下轻易吸附并解析目标化合物，极大简化了提取过程，缩短了样品基质分离时长[6-8]。用于提取类固醇激素的磁性吸附剂包括磁性碳纳米管、铁包埋的多孔碳材料（MIL-53-C）、核-壳磁性共价有机骨架、磁性印迹纳米颗粒、磁性纳米聚吡咯、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）包覆的Fe3O4@辛酸NP、核-壳聚多巴胺涂覆的磁性纳米颗粒等[9]。磁性纳米颗粒（magnetic nanoparticles，MNPs）因其稳定性高、比表面积大而广泛应用于药业、化妆品、工业及食品行业的检测。传统的MNPs有Fe3O4、ZnFe2O4、Ni/NiO@GrC、MnFe2O4和NiMn2O4。Fe3O4由于其成本相对较低和简单的合成过程及对人体健康和环境的低毒性而成为最受欢迎的一种MNPs[10]。

对近年来利用不同类型磁性纳米复合材料制备的新型磁性吸附剂在食品添加剂检测中的应用研究进行综述，回顾磁性吸附剂的研究进展。同时，讨论磁性固相萃取在食品添加剂检测分析中的最新进展，为其在食品安全分析中的应用提供理论依据。

1 类固醇激素及其检测技术

1.1 类固醇激素

类固醇激素根据作用不同可分为雌激素、雄激素、孕激素和糖皮质激素4大类。这类物质的化学结构共享一个相同的环戊烷多氢菲核[2-3]。它们由内分泌腺产生，随血液运送至全身。在胆固醇衍化及各种酶的作用下经复杂的转化链形成不同的SHs[1]。其复杂的合成代谢途径使得准确检测面临很大困难。大多数SHs会随着人体及动物排泄过程进入环境，研究表明，环境中的SHs多数存在于废水及土壤中，且不易降解。很有可能随着食物链重新进入人体[11]。进入人体后会改变荷尔蒙水平，扰乱生物体的体内稳态系统，增加人类罹患心血管疾病，前列腺癌和乳腺癌等风险[7,9-10]。同时在动物饲料中非法使用激素药物导致肉品中激素残留的事件也时有发生，据报道[12]我国在监测和抽查中多次在动物源性食品中检出违禁激素类药物残留，出口食品屡发贸易壁垒事件，曾一度影响动物源性食品出口量，是激素监控的重点[13]。因此开发良好准确的分析方法十分重要，同时为保障消费者健康及我国进出口贸易往来，必须建立灵敏度高、特异性好、可靠的动物源性食品中类固醇激素检测方法，提高监管有效性。

图1 典型类固醇激素结构图

图2 磁性固相萃取过程

1.2 检测方法

1.2.1 前处理技术

传统的前处理技术包括固相萃取（SPE）、液液萃取（LLE）、固相微萃取（SPME）、磁性固相萃取（MSPE）和QuEChERS等[3,5,10-11,13]。固相萃取（SPE）是样品制备中使用最广泛的方法。然而，SPE存在回收率低、操作繁琐等局限性。当油性成分过多或目标物颗粒较大时就会堵塞色谱柱，导致回收率绛低[14]。QuEChERS以其快速、简便、便宜、有效、坚固和安全的特点引起更多关注。通过添加颗粒吸附剂（PSA、C18、无水MgSO4和中性Al2O3等），也存在用ZnO代替无水MgSO4和NaCl进行目标物的提取。该方法在一定程度上弥补SPE耗时长的缺点，且已成功用于检测各种复杂基质中的化合物，如兽药、农药、激素和霉菌毒素[15]。磁性固相萃取（MSPE）作为一种新型前处理技术，因其耗时短、操作简单和高选择性而备受关注。

1.2.2 检测技术

痕量分析方法主要有气相色谱法、液相色谱法、超高效液相色谱法、气相色谱质谱联用法和液相色谱质谱联用法等[15-16]。气相色谱区别于液相色谱的主要特点是其在上机检测前需要进行繁杂的衍生化步骤。二者均具有灵敏度高、选择性好的优点，气相色谱质谱联用法分析的抗干扰能力强，液相色谱串联质谱检测的检出限较低[17-18]。

2 磁性纳米材料在类固醇激素检测中的应用

2.1 磁性纳米材料

磁性纳米材料作为吸附剂，可以很好地分散在水溶液中，并借助外部磁场进行分离。功能化的磁性纳米材料应用前景十分广泛[19]，表面的磁性涂层通常会对磁性产生重大影响，2种不同磁性相的结合将产生新的磁性纳米复合材料，进一步扩大应用范围。磁球表面接枝的有机官能团通过化学作用力（疏水相互作用、范德华力、氢键和π-π共轭等）可特异性吸附化合物[20-21]。裸露的纳米粒子活性很高，易在空气中发生氧化，损失其磁性及分散性[22]。因此可以在磁性粒子表面通过包覆方式添加保护膜保持其活性如接枝或涂覆有机物，包括表面活性剂或聚合物，或涂覆有无机层如二氧化硅或碳[23]。合适的表面涂层可以一定程度上减少团聚及沉淀现象，提高纳米颗粒在检测中的循环使用次数[24]。应用于类固醇激素提取的磁性材料涂覆层有聚苯胺（PANI）、聚多巴胺（PDA）、MIL-101（Cr）、聚四氢呋喃（PTHF）、羰基纳米颗粒（石墨烯、氧化石墨烯、碳纳米管和C60等）、金属有机骨架和环糊精（CD）[25]。聚苯胺（PANI）因其简单的合成步骤，高的热稳定性，良好的提取性能和低成本，被广泛应用。PANI具有丰富的苯环和氨基结构，可产生π-π相互作用，氢键和疏水作用因此可用于提取结构含有苯和羟基的类固醇激素[26-27]。PDA涂覆层具有羟基、氨基等官能团。既可与磁性材料结合又可通过疏水作用、π-π堆积和氢键等作用力进一步接枝其他活性功能成分[29]，其最常用于包覆Fe3O4形成核壳型的Fe3O4@PDA MNPs。CD是一种由D-吡喃葡萄糖单元聚合而成的环状低聚糖，它独特的化学结构-疏水性空腔和亲水性外表面使其成为一种良好的吸附剂[30]。

常见的纳米颗粒合成方法包括共沉淀、热分解、热还原、微乳法、水热合成和激光热解技术[31]。共沉淀是合成Fe3O4的一种简便方法，指在反应试剂中通过化合物沉淀的方式形成新的混合物[32-34]。通过控制Fe2+/Fe3+比例，并用沉淀剂调节混合液的pH进行合成。反应在N2保护下进行，剧烈搅拌一段时间后会生成黑色沉淀物，采用磁铁吸附分离，反复用水和有机溶剂洗涤，真空干燥后即可得到Fe3O4粒子。该方法因操作简便成为应用最广的制作方法，但也存在明显弊端，即合成的磁性颗粒易聚团，从而减少反应的比表面积与活性位点，降低吸附性能。

水热法指用水溶液作为反应体系，通过在高压釜中升温热加压，创造出一个相对密闭的高温高压环境，使得物质重新结晶的一种方法[35]。该方法制得的粉体粒度小，团聚现象较轻，且颗粒分布均匀[36]。主要特点即温度与压力，其温度在130～250 ℃之间。水热法一般只能制备氧化物粉体，而反应过程中的晶核形成与生长过程的影响因素并没有太多深入研究的有效结论[37]。

微乳法是将磁性纳米颗粒形成，聚集和团聚的过程控制在一个微小的球形液滴内，从而避免成型后的磁性颗粒进一步聚团。消除吸附过程中团聚现象引发的回收率低的问题。该方法合成的颗粒粒度较窄，更易控制[38]。

溶胶-凝胶法[39]是指由一种前驱体混合物经水解，缩合等化学反应后形成稳定的透明体系。再经固化热处理后形成固体化合物的方法。常见的前驱体物质包括酯类化合物或金属醇盐等。根据形成机制不同可分为3种类型[40]：传统凝胶型、无机聚合物型和络合物型。其操作成本昂贵，且原料物具有一定毒性，凝胶时间较长。

磁性纳米粒子的大小，形状和组成在很大程度上取决于所用盐的类型（例如，氯化物，硫酸盐，硝酸盐），Fe2+/Fe3+比率，反应温度，pH和介质的离子强度。通常为10～20 nm[41]。

2.2 磁性复合材料在类固醇激素检测中的应用与研究

An等[42]首次提出基于Fe3O4磁性纳米颗粒（MNPs）的新型磁性固相萃取技术。用溶剂热合成法合成Fe3O4颗粒，通过多巴胺的氧化自聚反应包覆在Fe3O4表面形成聚多巴胺涂层，MNPs表面的PDA将含有Au的金属盐还原得到Fe3O4@PDA@AU，经试验得到的这种高效的磁性吸附剂Fe3O4@PDA@Au可有效提取出尿液、牛奶和水样中的类固醇激素，目标物的线性范围为0.8～500 μg/L，并且都具有良好相关性（R2≥0.991），检出限为0.20～0.25 μg/L，相对标准偏差为0.83%～4.63%。经评估该吸附剂可循环使用4次。Lekota等[43]合成Fe3O4-Al2O3@CNFs纳米复合材料，并在此基础上建立一种超声波辅助分散磁性固相萃取的前处理方法，结合高效液相色谱和二极管阵列检测器（HPLC-DAD）定量检测废水中的17-βE2。该方法线性范围较广为0.1～1 000 μg/L，线性相关系数为0.998 1，检出限为0.025 μg/L。Li等[44]用沉淀法制备出石墨烯作为磁性固相萃取材料，建立了用于分析测定水样中的双酚A的MSPE-HPLC方法。结果显示Fe3O4@G对双酚A具有良好的富集作用。在5.0～1 000.0 μg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数为0.999 7。检出限为0.1 μg/L，回收率在88.19%～99.56%之间（SRSD＜3.00%）。

2.3 磁性金属有机骨架材料在类固醇激素检测中的应用与研究

金属-有机骨架（MOF）是一类从内置纳米多孔杂化材料的自组装之间的金属离子（或簇）和有机配位体[45]。较为成熟的MOF材料有HKUST、UiO、ZIF、MIL。ZIF是一类沸石咪唑酯骨架材料，是利用咪唑与Zn（Ⅱ）或Co（Ⅱ）的配位反应合成的沸石类结构MOF材料[46-47]。MIL材料是使用不同的过渡金属元素和琥珀酸，戊二酸等二羧酸配体合成。目前已成功应用于提取SHs的有MIL-53（Al）、MIL-100（Fe）和MIL-101（Cr）[47]。在众多MIL材料中，MIL-101（Cr）的超高孔隙率，多个不饱和铬位及出色的溶剂稳定性使其获得广泛的应用与关注，被成功应用于样品预处理过程中[48]。Wang等[49]将MIL-101（Cr）接枝在Fe3O4表面形成新型吸附剂Fe3O4@ MIL-101（Cr），并基于此材料建立一种MSPE-HPLC-MS/MS用于检测废水中的非甾体激素，且吸附剂用量仅30 mg。该方法回收率为81.2%～116.8%，线性范围在0.1～50 μg/L。Huang等[50]将Triton X-114作为亲水涂层通过疏水相互作用与MIL-101（Cr）表面相结合，提高其在水溶液中的分散性，增强吸附剂的吸附性能。用N-甲基-N-（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰胺作气相色谱前衍生化，建立一种GC-MS方法测定环境水样中的内分泌干扰物。

图3 典型吸附材料及吸附过程中可能存在的化学作用力

碳纳米管因其径向尺寸小，故而具有较大的比表面积，可分为单壁碳纳米管和多壁碳纳米管[51-52]。多面体低聚倍半硅氧烷（POSS）是纳米尺寸的笼状有机-无机杂化分子。POSS因其具有独特的笼状结构及纳米尺寸，可以增强生成的聚合物的热稳定性[53]。无机硅氧烷笼可提供热稳定性和机械强度，而有机取代基可提供与聚合物的相容性和反应性。该课题组合成Fe3O4@PAA与Fe3O4@PAA@POSS这2种纳米颗粒，并结合HPLC与HPLC-MS/MS，成功应用于肉制品及环境水中类固醇激素的检测。

2.4 磁性分子印迹材料在类固醇激素检测中的应用与研究

分子印迹技术即通过聚合洗脱等过程形成一个与被测物空间构型相匹配的特定空穴达到对模板分子及其类似物特异性吸附的作用。以无毒低成本的Fe3O4作为磁性主成分的研究较多[54]。具有专一性吸附作用的磁性纳米材料获得广泛关注。Czarny等[55]采用球形硅胶的分子印迹聚合物，建立一种分子印迹固相萃取高效液相色谱技术选择性地富集吸附水样中的类固醇激素。该方法具有高回收率（78.7%～101.3%）、低检出限（0.018 2～0.089 8 mg/L）的优点。Du等[8]通过可逆的加成-断裂链转移反应，制备出地塞米松的分子印迹聚合物。将其作为磁性吸附剂结合高效液相色谱技术用于快速，选择性地提取检测化妆品中地塞米松的含量。化妆品加标测试的回收率为93.8%～97.6%，相对标准偏差SRSD小于2.7%，检出限和定量限分别为0.05 μg/mL和0.20 μg/mL。

表1 磁性纳米材料在样品前处理过程中的应用

3 结语

磁性固相萃取的应用极大地缩短传统前处理方法存在的耗时长、吸附剂用量大、操作繁琐等弊端。磁性吸附剂的尺寸在纳米级别，一般为10～20 nm，因此微量合成好的磁性纳米材料即可满足检测需求，显著降低天平称量过程中不可避免引入的误差。磁性材料的改性合成是MSPE的核心，根据不同目标物选择不同的接枝官能团。通常吸附剂与目标物间的分子间作用力为共价键、疏水相互作用、氢键和π-π共轭等。溶液pH、磁性吸附剂用量及提取时长都是影响吸附效率的重要因素。今后研究方向应进一步增强MSPE的特意选择性，探索相关的化学作用力。类固醇激素结构相似，因此吸附剂与其相关作用力也基本相同，准确快速提取某种类固醇激素仍面临重大考验。