液质联用法测定贝类中麻痹毒素

赵晓野，梁琼*，王婷，王儒

海南省食品药品检验所海口分所（海口 570311）

众所周知，贝类毒素在贝类体内的积累是由于贝类的生活习性决定的，由于贝类无法自由移动，只能滤食其生活环境周围的海藻，近年来，由于海洋环境污染日益严重，赤潮爆发次数逐渐增多[1-2]，赤潮爆发时，贝类会大量滤食含有毒素的海藻，由于贝类自身对毒素不敏感[3]，造成毒素在其体内大量积累[4-5]，人类食用含有毒素的贝类产品时就会造成中毒现象。我国海岸线较长，海岸及底质类型多样，滩涂面积较大，贝类资源十分丰富，贝类也成了人们日常餐桌饮食的重要组成部分。但是，近年来时有食用贝类中毒的事件报道，给人们带来一定的恐慌。为保障消费者的食用安全，我国对贝类水产品进行严格管理和风险控制，并制定了贝类水产品及其制品的PSP限量标准。GB 2733—2015《食品安全国家标准鲜、冻动物性水产品卫生标准》中规定，贝类中的PSP最高限量为4 MU/g，联合国粮农组织、国际海洋学委员会、世界卫生组织及欧盟对PSTs最高限量值为800 STXeq μg/kg[6-7]，即每100 g贝类软组织中PSP毒性的STX当量值不得高于80 μg。

麻痹性贝类毒素（PSP）是一种分布范围广、致死率高、危害最大的天然海洋生物毒素，主要由亚历山大藻属的甲藻产生[8-9]，分为三类，分别为：氨基甲酰基类毒素（carbamoyl toxin），包括石房蛤毒素（STX）、新石房蛤毒素（NEO）、膝沟藻毒GTX1、GTX2、GTX3和GTX4；氨甲酰基-N-磺基类毒素（N-sulfocarbamoyl toxin），包括C1、C2、C3、C4、GTX5（B1）和GTX6（B2）；去氨甲酰基类毒素（decarbamoyl toxin），包括dcSTX、dcneoSTX、dcGTX1-4[10-12]。但是，食用含有麻痹毒素的贝类后会造成神经系统传输障碍而产生麻痹作用[13-16]，中毒初期会有口舌刺痛、麻木的感觉，随后可能会出现四肢失控，继而呼吸困难，严重者甚至会致命。目前还没有能治疗麻痹性贝类毒素中毒的特效药[17-18]，一旦中毒，基本只能依靠自身的解毒机能分解、清除毒素。因此，对贝类中的麻痹毒素进行监控十分必要。

常用的检测方法有小鼠生物测定法、酶联免疫分析法、高效液相色谱-荧光检测法、液相色谱-质谱联用法。LC-MS/MS由于具有选择性强、灵敏度高等特点，因此在贝类毒素的检测中具有明显优势[19-22]。试验主要对LC-MS/MS法检测麻痹性贝类毒素的技术进行深入研究，以期摸索一套简便易操作的方法进行推广，为贝类毒素的监管提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

海白螺（市售）。

PSP标准品：石房哈毒素（STX，66.3±1.4 μmol/L）、新石房哈毒素（NEO，65.1±2.1 μmol/L）、膝沟藻毒素1&4（GTX1&4，75.1±2.1 μmol/L）、膝沟藻毒素2&3（GTX2&3，146.1±6.9 μmol/L）、N-磺酰胺甲酰基毒素（GTX5，53.6±2.9 μmol/L）、脱氨甲酰基膝沟藻毒素2&3（dcGTX2&3，129.5±8.0 μmol/L）、脱氨甲酰基石房哈毒素（dcSTX，65.0±1.8 μmol/L），加拿大海洋研究中心。

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵（均为色谱纯）。

Prime HLB小柱、MAX小柱（美国Waters公司）。

QuEChERS盐包：含5 g硫酸镁、2 g氯化钠、150 mg C18粉末。

1.1.2 主要仪器与设备

液相色谱仪质谱联用仪（AB 5500+，美国AB SCIEX公司）；纯水仪（MILLI-Q型，美国Millipore公司）；高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；氮吹仪；均质器；涡旋振荡器；超声波清洗机。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理方法

1.2.1.1 样品制备

新鲜的贝类用清水冲洗干净，去壳，取出贝肉沥水后放入匀浆机中匀浆，倒入样品瓶中于-20 ℃冰箱中冷冻储存，备用。

1.2.1.2 提取

称取2 g（精确至0.01 g）样品置于50 mL离心管中，加10 mL 0.5%甲酸水，涡旋混匀5 min，超声提取5 min，于100 ℃水浴提取5 min，然后按10 000 r/min离心10 min，转移上清液至另一支50 mL离心管中。

1.2.1.3 净化

提取液中加入10 mL乙酸乙酯，涡旋混合1 min，按10 000 r/min离心10 min，弃去上层溶液。再加入10 mL三氯甲烷，涡旋混合1 min，按10 000 r/min离心10 min，取3 mL上层溶液分别加入Prime HLB中，收集流出液到15 mL刻度离心管中，加1 mL甲酸溶液（0.5%）至固相萃取柱中，收集流出液至3.5 mL。用5%甲酸水调节至pH 3.0，乙腈定容至8 mL。涡旋混匀后放置5 min，取1 mL过0.22 μm滤膜，所得滤液供液相色谱串联质谱测定。

1.2.2 液相色谱条件

色谱柱Hilic（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），柱温40 ℃，流速0.2 mL/min，进样量2 μL，流动相A为5 mmol/L甲酸铵（0.5%甲酸）溶液，流动相B为0.5%甲酸乙腈溶液。流动相洗脱程序：0～2 min，10% A；2～2.1 min，10%～30% A；2.1～4 min，30% A；4～4.1 min，30%～60% A；4.1～7 min，60% A；7～7.1 min，60%～10% A；7.1～12 min，10% A。

1.2.3 质谱条件

采用电喷雾离子源，以多反应监测模式进行正负离子同时扫描，喷雾电压4 500/-4 500 V，离子源温度550 ℃，DP电压100/-100 eV，麻痹性贝类毒素的母离子、子离子、碰撞能量见表1。

表1 麻痹性贝类毒素监测离子及碰撞能量

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的选择

将10种PSP标准品配成单个标准溶液，以针泵方式进样，分别对每个化合物进行正负离子扫描，在全扫描模式下，STX、dcSTX、neoSTX正离子模式下响应较高，确定的母离子分别为300.2，257.1和316.1。GTX1&4、GTX2&3、GTX5、dcGTX2&3在负离子模式下响应较高，确定的母离子分别为410.1，394，378.1和351.1。通过二级扫描，确定子离子，详见表1，进行多反应监测扫描，确定去簇电压和碰撞能，PSP各组分的色谱图见图1。

图1 PSP各组分定量离子色谱图

2.2 色谱柱的选择

配制100 ng/mL混合标准溶液，分别用Waters的BEH Hilic色谱柱和岛津的Amide色谱柱上机分离，在相同的流动相条件下Waters的BEH Hilic色谱柱分离效果及峰型较好，所以试验选择Waters的BEH Hilic色谱柱进行分离。

2.3 样品净化条件的选择

提取液中加入10 mL乙酸乙酯，涡旋混合1 min，按10 000 r/min离心10 min，弃去上层溶液。再加入10 mL三氯甲烷，涡旋混合1 min，按10 000 r/min离心10 min，各取3 mL上层溶液分别加入Prime HLB、MAX柱（MCX柱使用前需依次用5 mL甲醇、5 mL水和5 mL 0.5%的甲酸水溶液活化），收集流出液到10 mL刻度离心管中，加1 mL甲酸溶液（0.5%）至SPE小柱中，收集流出液至3.5 mL。用5%甲酸水调节至pH 3.0，乙腈定容至8 mL。涡旋混匀后放置5 min，取1 mL过0.22 μm滤膜，所得滤液供液相色谱串联质谱测定。

同时，另取5 mL经乙酸乙酯和三氯甲烷除杂的上层溶液注入装有QuEChERS盐包的离心管，涡旋混匀1 min，按10 000 r/min离心5 min，取上清液通过0.22 μm滤膜过滤，所得滤液供液相色谱串联质谱测定。

几种净化方式相比，QuEChERS盐包操作上最简便快捷，其次是Prime HLB，最后是MAX小柱。通过加标回收测定，Prime HLB小柱净化杂峰最少，有效改善峰型，回收率最好，均在80%以上，其次是MCX小柱，回收率在72%以上，回收率最低的为QuEChERS盐包，仅有60%左右。综合考虑，确定用Prime HLB小柱净化。

2.4 线性范围、回收率、精密度和定量限

考虑到样品基质对液质法测定PSP的影响，以海白螺空白基质处理液配制10～400 ng/mL范围的标准曲线，曲线各点分别为10，20，50，100，200和400 ng/mL，以PSP的质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到的回归方程的相关系数均在0.995以上，线性范围良好，详见表2。

表2 麻痹性贝类毒素的线性方程、相关系数

选取160，800和1 600 μg/kg高、中、低3个含量水平，用海白螺做基质进行回收率测试，3个点的平均回收率均在80.8%～93.3%之间，每个加标点连续进样6针的峰面积相对标准偏差均小于5%，详见表3。

表3 麻痹性贝类毒素的回收率、精密度（n=6）

在空白样品中添加24 μg/kg的麻痹毒素标准品，经提取净化处理后上机测定，各组分峰的信噪比均大于10，因此，将24 μg/kg作为各组分的定量限。

3 结论

贝类是深受大众喜爱的一种海鲜产品，但由于麻痹毒素中毒事件的频发，非常有必要建立快速、准确的毒素检测方法。由于麻痹毒素是一类四氢嘌呤三环化合物，分子量较低，没有紫外吸收，易溶于水，微溶于甲醇和乙醇，不溶于非极性溶剂，根据麻痹毒素的物理及化学性质，建立用0.5%甲酸水作为提取液，非极性有机溶剂乙酸乙酯和三氯甲烷除杂，Prime HLB小柱净化，超高效液相色谱质谱联用仪测定10种贝类毒素的检测方法，同时优化净化的条件、色谱及质谱条件，降低基质对样品中麻痹毒素定量的干扰。通过加标回收验证，该方法回收率较高、重现性较好，可用于贝类中麻痹毒素的检测。