大孔吸附树脂法纯化黑玉米花青素工艺

2022-06-13王晓婷康明丽宋丽君闫家荫

食品工业 2022年5期

王晓婷，康明丽*，宋丽君，闫家荫

河北科技大学食品与生物学院（石家庄 050018）

黑玉米（Black corn，ZeamaysL.）又称为黑糯米、紫玉米，是被子植物门单子叶植物纲，为禾本目玉蜀黍属植物[1]。与其他谷物相比，营养价值极高[2]，并且含有丰富的微量元素、不饱和脂肪酸和人体必需氨基酸，尤其含有丰富的花青素，赋予黑玉米多种保健功能，既可作为粮食食用也可用于保健产品中。在膳食健康化的新潮流下，黑玉米产业迅速发展，又因其易于种植且产量较高而产地遍布全国[3]。虽然黑玉米中花青素含量较为丰富，但因提取出的黑玉米花青素粗提液含有大量多糖、脂肪和蛋白质而不易保存，且在黑玉米花青素纯化工艺方面还未完善，所以亟需选取合适的纯化方法对其进行纯化。

大孔吸附树脂是一类具有大孔结构的高分子吸附材料，主要通过物理途径进行筛选和纯化样品。根据不同的极性和单体结构的不同，主要分为极性、中极性和非极性3类[4]。据研究报道，利用大孔吸附树脂在中草药成分纯化中做过大量研究，如黄酮类化合物精制、皂苷类精制、生物碱类精制以及复方制剂类精制等[8]。大孔吸附树脂法纯化花青素的研究较多，如：赵文娟等[5]利用大孔吸附树脂法分离纯化黑果枸杞中的原花青素，探究其分离纯化的工艺条件；刘丽南等[6]利用大孔树脂法对山楂中的原花青素进行分离纯化，并对动脉血管的舒张作用进行探究；原红霞等[7]在5种大孔吸附树脂中筛选出分离纯化静乐黑枸杞花青素的最佳大孔吸附树脂，并优化其纯化条件。黑玉米花青素的研究重点在于其营养保健功能和特殊药理作用两方面[21]，对黑玉米花青素纯化工艺尚待优化。试验在相关参考文献基础上，选用3种不同极性的大孔吸附树脂，通过静态吸附和解吸试验筛选出适合分离纯化黑玉米花青素的大孔吸附树脂，对静态、动态吸附和解吸试验进行研究，探究对黑玉米花青素最佳的分离纯化条件，并与纯化前浓度进行对比，为黑玉米花青素纯化工艺提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 黑玉米花青素的提取

“黑珍珠”黑玉米，采摘自河北省邢台市威县，采摘时间为2020年5月。取新鲜黑玉米籽粒在60 ℃恒温干燥后磨粉并过0.452 mm（40目）筛得粗提物，在干燥、0 ℃且避光的场所保存。将浓度52%的酸性酶液添加到粗提物中，在40 ℃下恒温振摇15 min后抽滤，将所收集的滤液置于旋转蒸发仪中进行富集浓缩，在转速5 000 r/min条件下高速离心20 min，去除蛋白质、脂肪等杂质得到浓缩后的滤液，于0 ℃低温储存备用。

1.1.2 试验药品

乙酸乙酯（分析纯，天津市永大化学制剂厂）；AB-8型大孔吸附树脂（一级品，天津市光复精细化工厂）；X-5型大孔吸附树脂（一级品，天津市光复精细化工厂）；DM130型大孔吸附树脂（一级品，天津市光复精细化工厂）；氢氧化钠（分析纯，天津市大陆化学试剂厂）；盐酸（优级纯，天津市欧博凯化工有限公司）；无水乙醇（分析纯，天津市永大化学制剂厂）；纤维素酶（生化试剂，北京索莱宝科技有限公司）；石油醚（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；柠檬酸（分析纯，天津市大陆化工有限公司）；抗坏血酸（分析纯，天津欧博凯化工有限公司）。

1.1.3 仪器与设备

FA2204B电子天平（上海市安亭电子仪器厂）；RE-600旋转蒸发仪（上海市亚荣生化仪器厂）；LGJ-10D真空冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂有限公司）；FW-100高速万能粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）；DHG-9003BS电热恒温鼓风干燥箱（上海新苗医疗仪器制造有限公司）；UV-5100B紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 大孔吸附树脂的活化

参考许先猛等[9]的方法对大孔吸附树脂进行活化，对3种大孔吸附树脂分别使用90%的乙醇浸泡24 h，抽滤晾干，加入蒸馏水重复冲洗至水不浑浊再抽滤至无醇味为止，使用去离子水配制的5%氢氧化钠溶液，按照2∶1比例对大孔吸附树脂浸泡12 h，抽滤晾干，加入蒸馏水重复冲洗至水不浑浊再抽滤至无醇味为止，使用去离子水配制的5%盐酸溶液，按照2∶1比例对大孔吸附树脂浸泡12 h，之后抽滤晾干，加入蒸馏水重复冲洗再抽滤直至中性且无明显味道。晾干，常温下储存备用。

1.2.2 静态吸附率和解吸率的计算

准确称取2.0 g大孔吸附树脂于150 mL锥形瓶中，加入40 mL黑玉米花青素粗提液样品溶液，在25 ℃条件下恒温振荡12 h，振荡速率250 r/min，抽滤晾干，用100 mL 90%乙醇洗脱。通过式（1）和（2）计算吸附率和解析率。

式中：c初始为样液吸附前的初始浓度，mg/mL；c吸附后为样液吸附后的吸附浓度，mg/mL；c解吸液为解吸液中花青素的浓度，mg/mL；V解吸液为解吸液的体积，mL；V吸附后为平衡吸附后样液的体积，mL。

1.2.3 大孔吸附树脂对黑玉米花青素静态吸附与解吸试验

1.2.3.1 吸附时间对大孔吸附树脂吸附效果的影响

准确称取2.0 g大孔吸附树脂于150 mL锥形瓶中，加入40 mL 1.5 mg/mL黑玉米花青素粗提液样品溶液，在25 ℃条件下恒温振荡12 h，振荡速率250 r/min，每隔1 h取样测定样品中的黑玉米花青素含量，以时间为横坐标、吸附率为纵坐标，绘制大孔吸附树脂的静态吸附动力学曲线[10]。

1.2.3.2 吸附温度对大孔吸附树脂吸附效果的影响

准确称取2.0 g大孔吸附树脂于150 mL锥形瓶中，加入40 mL 1.5 mg/mL黑玉米花青素粗提液样品溶液，在15，20，25，30和35 ℃条件下恒温振荡12 h，振荡速率250 r/min，每隔1 h取样测定样品中的黑玉米花青素的含量，以时间为横坐标、吸附率为纵坐标，绘制大孔吸附树脂的静态吸附动力学曲线。

1.2.3.3 pH对大孔吸附树脂吸附效果的影响

准确称取2.0 g大孔吸附树脂于150 mL锥形瓶中，加入40 mL 1.5 mg/mL的黑玉米花青素粗提液样品溶液，在25 ℃条件下恒温振荡12 h，并用5%磷酸氢二钠和5%磷酸二氢钠微调样品pH为2.0，3.0，4.0，5.0和6.0，振荡速率250 r/min，每隔1 h取样测定样品中的黑玉米花青素含量，以时间为横坐标、吸附率为纵坐标，绘制大孔吸附树脂的静态吸附动力学曲线。

1.2.3.4 大孔吸附树脂的解吸动力学曲线

将吸附完全的大孔吸附树脂抽滤晾干置于具塞锥形瓶中，加入不同体积分数乙醇溶液对大孔树脂进行解吸，并以时间为横坐标，解吸液中的黑玉米花青素含量为纵坐标，绘制静态解吸曲线[11]。

1.2.4 大孔吸附树脂对黑玉米花青素动态吸附与解吸试验

上样黑玉米花青素粗提液经过已处理的大孔吸附树脂，通过湿法装柱至LG聚四氟活塞层析柱中层析，收集层析后的滤液，测定吸附残液中的黑玉米花青素浓度。因在大孔吸附树脂的吸附下，随着样液体积的增加，花青素浓度降低，为表现在不同条件下大孔吸附树脂的吸附效果，以吸附残液的体积为横坐标、残液中的黑玉米花青素浓度为纵坐标，绘制花青素动态吸附曲线。在达到泄漏点浓度（即吸附滤液浓度为进样前浓度的1/10）时停止进样。用蒸馏水清洗层析柱并取出作为滤层的大孔吸附树脂，此时大孔吸附树脂吸附几近饱和，使用一定体积分数的乙醇溶液为解吸剂对大孔吸附树脂进行洗脱，以解吸液的体积为横坐标、解吸液中的花青素含量为纵坐标，绘制动态解吸曲线[12]。

1.2.4.1 上样量对动态吸附效果的影响

当滤液中的花青素浓度为上样提取液中花青素浓度的1/10时，认为达到泄漏点浓度。收集50 mL经过预处理的大孔吸附树脂，湿法装柱装入层析柱中，加入120 mL质量浓度1.5 mg/mL黑玉米花青素粗提液，控制其流速60 mL/h，收集滤液，每10 mL为1个单位，测定其中的花青素浓度，并以滤液体积为横坐标，10 mL滤液中的黑玉米花青素浓度为纵坐标，绘制动态吸附曲线。

1.2.4.2 上样流速对动态吸附效果的影响

在层析柱中湿法装柱50 mL经过预处理的大孔吸附树脂，并加入120 mL质量浓度1.5 mg/mL黑玉米花青素粗提液，控制其流速为20，40，60，80和100 mL/h，收集滤液，每10 mL为1个单位，测定其中的花青素浓度，并以滤液体积为横坐标，10 mL滤液中的黑玉米花青素浓度为纵坐标，绘制动态吸附曲线。

1.2.4.3 解吸液浓度对动态解吸效果的影响

对吸附饱和的大孔吸附树脂需要使用合适的解吸液进行解吸处理，解吸液的选择主要是不同体积分数的乙醇溶液。因此，选择使用150 mL的40%，50%，60%，70%和80%的乙醇溶液，以流速60 mL/h进行解吸，以10 mL为1个单位收集解吸液并测定黑玉米花青素浓度，以滤液体积为横坐标，10 mL解吸液中的黑玉米花青素浓度为纵坐标，绘制动态解吸曲线。

1.2.4.4 解吸流速对动态解吸效果的影响

对吸附饱和的大孔吸附树脂需要使用合适的解吸液进行解吸处理，解吸液为150 mL体积分数60%的乙醇溶液，以流速20，40，60，80和100 mL/h进行解吸，测定解吸液中的黑玉米花青素解吸率，以解吸液流速为横坐标，解吸率为纵坐标，绘制动态解吸柱形图。纯化效率验证试验取纯化后的黑玉米花青素提取液于分光光度计，根据花青素标准品标准曲线计算浓度，对比纯化前的提取液，比较纯度差异[13]。

1.3 数据处理

每组试验重复3次，结果以平均值±标准差的形式表示，使用SPSS Statistics 25进行数据分析，通过Duncan检验分析各组数据的差异显著性（p＜0.05），并使用Origin 2019绘图。

2 试验结果

2.1 大孔吸附树脂对黑玉米花青素静态吸附与解吸试验结果

2.1.1 不同大孔吸附树脂的选择

对3种大孔吸附树脂进行静态吸附和解吸试验，结果如图1所示。在静态吸附试验时，AB-8型树脂的吸附率可达91.3%，DM-130型树脂的吸附率达84.9%，而X-5型树脂的吸附率较小，结果为76.6%。可能是花青素含有多个羟基和酚羟基基团，比较容易被含有酯基的吸附树脂所吸引形成氢键结合，从而分离亲水物质和疏水物质，而AB-8型树脂属于弱极性大孔吸附树脂，对水溶性、弱极性物质的纯化极佳，所以能够达到较高的吸附率。X-5型树脂主要为苯乙烯型非极性共聚体，适用于大分子物质分离纯化[14]，对于花青素杂质的吸附过多，造成成品含量较低。DM-130型树脂为聚苯乙烯型吸附树脂，适用于具有疏水性的物质提取[15]，较AB-8型有一定差异。解吸过程中，与X-5型树脂和DM-130型树脂相比，AB-8型树脂的解吸率较高。综合吸附试验考虑，AB-8型大孔吸附树脂更适合用于对花青素的吸附。

图1 不同大孔吸附树脂的选择结果

2.1.2 吸附时间对AB-8型大孔吸附树脂吸附效果的影响

由图2可以看出，AB-8型大孔吸附树脂在0～2 h内吸附率急剧增加，在9 h后增长速率减缓，之后达到吸附平衡，并在12 h时吸附率达97.6%。通过试验可以得知，AB-8型大孔吸附树脂对黑玉米花青素具有良好的吸附效果，出现先增快后增慢的情况主要原因可能是前期即0～7 h时吸附树脂未饱和，开始大量吸附花青素，到后期9～12 h时吸附近饱和，原因可能是AB-8型大孔吸附树脂中的疏水基开始排斥有效物质或者粗提液中花青素吸附完毕，导致吸附率达到最高点并保持平衡。因此，根据吸附动力学研究，大孔吸附树脂的吸附时间9 h较好。

图2 吸附时间对AB-8型大孔吸附树脂吸附率的影响

2.1.3 吸附温度对AB-8型大孔吸附树脂吸附效果的影响

由图3可以看出，温度对AB-8型大孔吸附树脂的吸附效果有显著的影响。温度在15～25 ℃时，吸附率逐渐增大，在15～35 ℃时吸附率逐渐降低，在25 ℃时达到最高点。原因可能是高温下，分子活动剧烈，吸附树脂不易形成分子键对有效物质进行捆绑，温度过低又导致有效成分分子活动速率减小不利于分子键力的形成，从而吸附率降低[16]。因此，采用25 ℃作为AB-8型大孔吸附树脂的静态吸附的温度较好。

图3 温度对AB-8型大孔吸附树脂吸附率的影响

2.1.4 pH对AB-8型大孔吸附树脂吸附效果的影响

由图4可以看出，pH对大孔吸附树脂的吸附能力有较大影响。pH 2～3时，AB-8型吸附树脂的吸附率较低，pH 5时吸附率最高。pH 5～9时，吸附率逐渐降低。原因可能是黑玉米花青素为弱酸性物质，因此更适合在酸性条件下进行吸附，碱性环境还可能会破坏花青素的结合键位，造成吸附率不高，吸附效果不好[17]。在酸性条件下对花青素吸附率较低的原因是酸性环境使大孔吸附树脂失水，大孔吸附树脂孔径增大，导致对花青素吸附率较低[18]。因此，采用pH 5作为AB-8型大孔吸附树脂的静态吸附的试验条件较好。

图4 pH对AB-8型大孔吸附树脂吸附率的影响

2.2 动态吸附试验

2.2.1 上样量对AB-8型大孔吸附树脂吸附效果的影响上样量对AB-8型大孔吸附树脂吸附效果的影响如图5所示。样品体积40 mL时，残液质量浓度为0.149 mg/mL，为原提取液质量浓度1.5 mg/mL的10%，即残液质量浓度达到泄漏点质量浓度。残液质量浓度达到样品质量浓度的1/10时的样品量为最佳上样量体积，即残液质量浓度突然增大时的体积作为上样终点。过少的上样量可能会导致吸附效率降低，无法发挥吸附能力，而过多的上样量会导致大孔吸附树脂再生能力减弱，造成试验样品的浪费，也导致大孔吸附树脂的吸附效率降低，所以选择上样量40 mL较好。

图5 上样量对AB-8型大孔吸附树脂吸附效果的影响

2.2.2 上样流速对AB-8型大孔吸附树脂吸附效果的影响

上样流速不同，导致花青素分子在AB-8型大孔吸附树脂内部的扩散作用不同，因此上样流速对吸附效果的影响较大。在不同流速的影响下，随着流出液体积增加，吸附率逐渐降低，使得残夜质量浓度上升。通过图6可以看出，流速20和40 mL/h时，流出液体积20 mL左右时残液质量浓度达到泄漏点浓度，使得泄漏点时的浓度过小，原因是上样流速过慢造成大孔吸附树脂吸附到上样样品饱和后无法持续吸附，造成吸附时间增长，吸附效率降低。上样流速80和100 mL/h时，流速过快，大孔吸附树脂还未吸附饱和，形成的分子键因为流速过快而被破坏，上样样品停留时间过短也会造成吸附效率降低，并且造成样品的过多耗费[19]。由图6可知，上样流速60 mL/h时，流出液体积20 mL即可达到泄漏点，耗费少，浓度高，吸附效率高，并且节约时间，有利于后期试验，故上样速率选择60 mL/h。

图6 上样速率对AB-8型大孔吸附树脂吸附效果的影响

2.2.3 解吸液浓度对AB-8型大孔吸附树脂解吸效果的影响

在不同体积分数乙醇溶液的洗脱下，解吸率表现出不同程度的增加，随着流出液体积增加，流出液中花青素浓度降低，以达到解吸效果。由图7可以看出，随着流出液体积增多，流出液质量浓度出现先增大后减小趋势，原因可能是随着洗涤液增多，原先吸附的有效物质逐渐减少，造成质量浓度降低。观察发现，所有洗涤液全部在25 mL出现质量浓度高峰，随后逐步降低。其中：40%和80%乙醇溶液洗涤时，在80和90 mL才达到泄漏点，对于洗涤液的体积要求过高；60%和70%乙醇溶液洗涤时，在80 mL时达到泄漏点，对于洗涤液浓度要求过高并且泄漏点明显滞后，造成效率过低；50%乙醇溶液洗涤时，泄漏点固定在60 mL，并且后续增加流出液体积，浓度变化不大，提取效率高。关于洗涤剂体积分数越高洗出液质量浓度反而越低，可能的原因是有效物质是黑玉米花青素，为水溶性物质，有机试剂浓度过高会导致溶液溶解的有效物质减少，达到饱和后不能继续溶解造成泄漏点之后，解吸效率减少[19]。因此综合考虑，试验选择50%的乙醇溶液为解吸液体积分数，并且解吸液体积为65 mL。

图7 解吸液体积分数对AB-8型大孔吸附树脂解吸效果的影响

2.2.4 解吸流速对AB-8型大孔吸附树脂解吸效果的影响

由图8可以看出，随着流速增加，解吸率呈先逐渐增长，再趋于平缓，最后呈逐渐下降趋势，流速50 mL/h时，解吸率达到最高。原因可能是：流速较慢时，解吸液在层析柱中停留时间过长，造成解吸液解吸饱和，解析效率较低，之后提高流速，吸附效率逐渐增高，最后因流速过快，解吸液未能成功洗脱而直接流出层析柱[20]，造成浪费，解吸效率也逐渐降低。因此，综合考虑选择解吸流速50 mL/h较为合适。

图8 解吸流速对AB-8型大孔吸附树脂的解吸效果的影响

2.2.5 纯化效率验证试验

经过对纯化数据验证，与未处理的花青素粗提液纯度40.5%相比，纯化后黑玉米花青素提取液纯度达73.8%，浓度提高近1倍，说明大孔吸附树脂有效提高黑玉米花青素浓度。

3 讨论

通过AB-8型大孔吸附树脂对黑玉米花青素进行分离纯化，AB-8型大孔吸附树脂可有效分离黑玉米花青素粗提液中的杂质成分，提高黑玉米花青素的纯度。与前人研究对比，效果较明显。

3.1 利用同种类型的大孔吸附树脂纯化效果不同

杨敏[24]利用AB-8型大孔吸附树脂纯化紫玉米中的花青素，可将纯度提高至89.6%，纯化效果显著，原因是利用乙醇提取的粗提液中紫玉米花青素的含量较高，提取率较高，为90.49%，在纯化过程中可显著提高紫玉米花青素的纯度。

3.2 利用不同种类型的大孔吸附树脂纯化效果不同

原红霞等[7]利用HPD100型大孔吸附树脂纯化静乐黑枸杞花青素后，纯度提高至17.82%，纯化效果不明显，原因是非极性吸附树脂，与弱极性吸附树脂的AB-8型大孔吸附树脂相比，纯化花青素的效果较差，且因原料的不同，导致纯化效果的差异。许志新等[23]利用D-101型大孔吸附树脂纯化紫玉米籽粒与穗轴中的花青素，利用70%乙醇-0.02%盐酸（V/V）作为解吸液，纯化后穗轴花青素纯度提高至29.76%，籽粒花青素纯度提高至22.64%，纯度较低，原因可能是D-101型大孔吸附树脂属于非极性树脂，在解吸液的选择中，利用乙醇-盐酸的混合液作为解吸液不利于黑玉米花青素的纯化，纯化效果较差。朱敏等[25]筛选出X-5型大孔吸附树脂对黑玉米花青素提取效果较好，与AB-8型大孔吸附树脂吸附率接近，原因是X-5型树脂的吸附率常数较大，对黑玉米花青素的吸附速率快吸附效果好。

3.3 利用同种大孔吸附树脂对不同物质纯化效果不同

李三省等[22]利用AB-8型大孔吸附树脂纯化黑果枸杞中的原花青素，纯化后浓度提高至62.36%，纯化浓度不高，原因可能是AB-8型大孔吸附树脂属于弱极性吸附树脂，对原花青素的吸附效果较差而对花青素的吸附效果较好，故利用AB-8型大孔吸附树脂纯化原花青素效果较差。陈红玲等[26]利用AB-8型大孔树脂纯化玉米须中的总黄酮，纯化效果较高，纯度为87.9%，原因可能是总黄酮属于黄酮类物质，与花青素相比，更适合于AB-8型大孔吸附树脂的纯化。

利用试验条件纯化效果显著，纯化度较高，具有重要的研究意义，从而完善黑玉米花青素的分离纯化工艺。