等离子体处理对西兰花芽苗生产及活性物质含量的影响

高诗薇，朱禹蒙，王齐蕾，曹 倩，王承健，吕新刚

（西北大学食品科学与工程学院，陕西西安 710069）

随着社会经济的发展，人们对饮食健康愈发重视，一些高营养价值的食品成为消费者的首选。十字花科蔬菜含有丰富的维生素、膳食纤维、硫代葡萄糖苷（Glucosinolates，GLs）等重要活性物质，具有很高的营养价值[1-2]。西兰花（Brassica oleraceaL.var.italic Planch），是十字花科芸薹属一年生植物，其被称为天然抗氧化蔬菜。研究表明，西兰花有助于预防多种癌症疾病的发生[3]。这主要归因于西兰花中含有丰富的硫苷，其在黑芥子酶的作用下形成的水解产物异硫氰酸酯（Isothiocyanate，ITCs）具有显著的抗癌活性[4]。萝卜硫素（Sulforaphane，SF）被证实是异硫氰酸酯中最有效的活性物质之一[5]。西兰花芽苗中萝卜硫素含量是西兰花的几十倍，是萝卜硫素良好来源，但由于西兰花种子价格高，特别的种子中萝卜硫素含量越高，其价格也越高，由此导致获取成本居高不下。因此，低成本实现西兰花芽苗中萝卜硫素的富集，降低萝卜硫素的获取成本，对提升西兰花芽苗在疾病预防中的作用具有重要意义。

图 1 等离子体装置示意图Fig.1 Schematic diagram of plasma device

研究表明，外源化学或物理方法处理可诱导西兰花芽苗中萝卜硫素的积累。初婷等[6]外源喷洒MgSO4处理芽苗可显著提高萝卜硫素含量，较对照组增加了68.2%；利用热激处理西兰花芽苗提取萝卜硫素，7d热激胁迫下西兰花芽苗中萝卜硫素的形成量是对照的2.54倍[6]；韩宇等[7]研究经高温联合喷施ZnSO4及Na2SeO3处理芽苗可提高萝卜硫素含量，较单独喷施ZnSO4处理增加了39%；Selcuk等[8]对西兰花芽苗菜的研究表明，UV-B可诱导硫代葡萄糖苷的合成，在UV-B辐射24 h下除促进山奈酚和槲皮素的积累还可促进萝卜硫素含量。

等离子体处理是近年来迅速发展起来的用于种子萌发的新型加工技术。等离子体环境是一个具有光、电、磁及活性粒子的综合环境。经该综合环境中的某个因素或多综合因素处理后的植物种子，多方面的性质如萌发活力、发芽率、活性物质含量、抗胁迫能力等都会发生改变[6-9]。Saengha等研究芥菜种子经等离子体处理后，单位重量芽苗中总异硫氰酸酯含量增加了3.5倍，总酚增加了1.7倍，总类黄酮增加了近30倍，抗氧化活性显著增强[10]。Kim等研究等离子体处理对西兰花种子发芽率和理化性质，检测到等离子体能显著提高西兰花种子的发芽率和幼苗生长，而不影响其相应产品的理化和感官特性[11]。等离子体用于种子萌发处理，具有处理时间短、能耗低、操作方便、效果显著的特点，应用前景广阔。

等离子体处理如何影响西兰花芽苗中生物活性物质含量目前仍缺乏系统研究。本研究首先研究不同等离子体处理条件对西兰花芽苗中萝卜硫素含量影响，其次明确等离子体处理对不同品种西兰花芽苗中总硫苷、萝卜硫素、多酚等生物活性物质含量变化的影响，来为低成本获取富含萝卜硫素的西兰花芽苗产品提供技术支撑和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

西兰花种子：品种文兴（WX）、马尼拉（MNL）、曼陀绿（MTL）、绿宝石（LBS）、绿玉（LY）、绿剑（LJ）种子 厦门市文兴蔬菜种苗有限公司；生化试剂：98%黑芥子硫苷酸钾标准品 美国Sigma公司；甲醇（色谱纯） 上海陆都化学试剂厂；草酸、97.5%没食子酸标准品、98%芦丁标准品、福林酚 上海化学试剂有限公司；甲醇（分析纯）、乙醇（分析纯）、盐酸（分析纯）、磷酸（分析纯） 天津市天力化学试剂有限公司。

等离子体装置 南京苏曼等离子科技有限公司；智能恒温光照培养箱 山东恒美电子科技有限公司； LC-2030C 3D Plus型液相色谱质谱联用仪 日本岛津制作所；UV1800分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；UV-7504C型紫外可见分光光度计上海欣茂仪器有限公司；DK-S12型电热恒温水浴锅上海森信实验仪器有限公司；DICO型台式离心机

Thermo Fisher有限公司；BSA224S型电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；FD-1C-50型冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；KQ-250DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；PHS-3C pH计 上海佑科仪器有限公司；52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 等离子体处理西兰花种子 图1为实验室用等离子体机装置简单示意图，由等离子体发生器产生的高频交流信号经高压电缆线输入至包覆于扁口状石英管（管口规格为50 mm×5 mm）外的铝箔高压电极；在距离铝箔下边缘3 mm处放置一个单侧镀金属膜的石英介质板，金属膜的一侧向下放置充当低压电极与大地相连，从而形成完整的电回路；等离子体射流经发生器喷向石英管开口附近区域[12]。将每100粒待处理西兰花种子置于石英板上的等离子体射流区域进行处理，控制其对应电压值与时间。根据预实验结果，本研究中电压设置为25和30 V，处理时间设置为1、2和3 min。

1.2.2 西兰花芽苗的培养 将等离子体处理后和未处理西兰花种子用2%次氯酸钠消毒后，用蒸馏水洗至中性，于室温条件下浸泡8 h；将浸泡后的种子均匀的铺在发芽盘，将发芽盘整齐摆放于发芽箱中，在25 ℃条件下发芽（16 h光照，8 h黑暗）。每日4次喷固定量的蒸馏水，发芽至5 d收集芽苗，吸干水分后液氮冷冻，置于-80℃保存。

1.2.3 指标测定方法

1.2.3.1 芽苗发芽率 收集芽苗时记录发芽株数，按照公式（1）计算发芽率。

1.2.3.2 芽苗菜芽长与鲜质量的测定 将每组处理的西兰花芽苗都随机抽取50根芽苗为一个样本，用游标卡尺测量其长度。擦干表面水分并于精密电子天平称其质量，计算单株芽苗的质量。

1.2.4 萝卜硫素（SF）含量的测定 参照Lü等[13]的方法并修改，采用粉碎机粉碎液氮处理后的西兰花芽苗，取芽苗粉末1 g加入少量蒸馏水，置于55 ℃的水浴锅中漂烫15 min，迅速冷却，在瓷臼中研磨至匀浆，然后与pH4.0的磷酸盐缓冲液混合到一定的料液比5:1，添加抗坏血酸0.15 mg，将样品置于37℃的恒温振荡器中，酶解5.5 h。在酶解过程中，每隔30 min，37 ℃超声5 min。酶解结束后，冷冻干燥，加入5 mL丙酮30 ℃超声浸提30 min，离心（9000 r/min 10 min），收集上清液，残渣重复浸提。将合并的上清液30 ℃条件下旋转蒸发浓缩，甲醇溶解残留物质定容至3 mL，经0.45 μm有机滤膜过滤，收集滤液进HPLC测定含量，其含量由标准方程y=2E+07x+31972，R2=0.9998计算。HPLC条件：色谱柱：SB-C18色谱柱；检测波长：195 nm；流速：1 mL/ min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流动相：水:甲醇=72%:28%。结果用mg/g DW表示。

1.2.5 萝卜硫苷（GLs）含量的测定 参照李宁等[14]的方法并作修改。精确称取西兰花芽苗粉末0.5 g，以料液比1:6 g/mL加入超纯水3 mL，超声30 min，在10000 r/min条件下离心20 min后取上清液重复3次，用超纯水定容至5 mL，Sevag去蛋白后，在10000 r/min条件下离心20 min，过聚醚砜微孔滤膜，进HPLC检测，其含量由标准方程y=2E+07x-406176，R2=0.9992计算。HPLC条件：色谱柱：SB-C18色谱柱；检测波长：234 nm；流速：0.6 mL/ min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；流动相：0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液:甲醇=95%:5%。计算每克种子中GLs含量，结果用mg/g DW表示。

1.2.6 总酚（TP）含量的测定 参照Lü[13]等的方法并修改。称取西兰花芽苗0.5 g，加入50%甲醇研磨匀浆后离心；取上清液1 mL，加入1 mL福林-酚试剂、2 mL 20 g/L Na2CO3，暗处反应2 h，于765 nm波长处测定吸光度。以没食子酸作标准曲线，由标准方程y=19.17x+0.0485，R2=0.9954计算，结果以mg RE/g表示。

1.2.7 总黄酮（TF）含量的测定 参照Lü等[13]的方法并修改。称取0.5 g西兰花芽苗，加入50%甲醇研磨匀浆后离心；准确移取1 mL上清液，加入1 mL 5%NaNO2溶液，孵育6 min，再加入1 mL 10%Al（NO3）3，6 min后加入10 mL 4% NaOH， 混匀，15 min后，于510 nm处测定其吸光度，其含量由标准方程y=0.8939x+0.0163，R2=0.9953计算，结果以每克种子或芽苗中含有相当芦丁的亳克数表示，单位为mg RE/g。

1.2.8 DPPH自由基清除率的测定 参考Lü等[13]描述的方法，准确移取适当稀释后的样品溶液1 mL加入3 mL 0.1mmol/L DPPH溶液，混和均匀避光反应1 h于517 nm下测定溶液的吸光度无水乙醇作为参比。对照组（Acontrol）由1 mL甲醇和3 mL DPPH溶液组成，空白组（Ablank）由1 mL样品和3 mL甲醇组成。

以抗坏血酸作标准曲线，计算DPPH自由基清除能力，结果表示为mg TEAC/g 。

1.2.9 铁还原抗氧化能力（FRAP）的测定 参考Lü等[13]描述的方法进行测定。

FRAP工作液：0.3 mol/L醋酸盐缓冲液（pH3.6），0.02 mol/L FeCl3，0.01 mol/L TPTZ盐酸溶液（0.04 mol/L HCL）按照10:1:1的体积比混合，此工作液现用现配。

准确移取上清液400 μL加入3.6 mL FRAP工作液，混匀，37 ℃反应10 min后，于593 nm处测定其吸光度值。以FeSO4作标准曲线，求回归方程，计算样品的 FRAP值结果用mg Fe2+/g表示。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 不同等离子体处理条件对西兰花芽苗发芽情况及SF含量影响

2.1.1 不同等离子体处理条件对西兰花芽苗形态特征及发芽情况 图2为西兰花芽苗生长形态图，从图中看出不同等离子处理条件对西兰花芽苗生长状态均受到影响。相较于对照，经等离子体处理后，西兰花芽苗芽长均有所增长。

本实验处理使用文兴（WX）品种，保持等离子体处理电压为30 kV，处理时间不同对西兰花芽苗影响。表1结果表明，等离子体处理组发芽率相较对照无显著差异（P＞0.05）。经等离子体处理后，发芽3和5 d的芽长均高于对照，尤其是经等离子体处理2 min，芽长分别增加36.5%和32.1%，但无统计学差异（P＞0.05）。随等离子体处理时间延长，芽重呈先增加后降低趋势，在处理2 min时芽重数值最大，显著高于对照与其他处理组（P＜0.05）。

表1 不同等离子体处理条件对西兰花芽苗影响Table 1 Effects of different plasma treatment conditions on broccoli sprouts

2.1.2 不同等离子体处理条件对西兰花芽苗SF含量影响 图3可知，等离子体处理条件不同造成西兰花芽苗中萝卜硫素含量呈现出较大地差异性。相较于对照组，25和30 kV等离子体处理的西兰花芽苗中萝卜硫素最大含量分别提高了5.32倍和6.75倍。不同电压下，处理时长对萝卜硫素含量影响存在差异。25 kV下，等离子体处理1和2 min时，各处理时间无显著差异，3 min处理较1～2 min时长处理降低约15%～20%；30 kV下，随处理时间延长，萝卜硫素含量呈先增加后降低趋势，在2 min时达到最大值，且较其他时间高50%以上。总体上，30 kV 2 min处理后的芽苗中萝卜硫素含量增加程度最高，达到3.24 mg/g DW。

图 2 不同等离子体处理条件对西兰花芽苗形态表征的影响Fig.2 Effects of different plasma treatment conditions on morphological characterization of broccoli sprouts

图 3 等离子处理电压和时间对西兰花芽苗SF含量影响Fig.3 Effects of plasma treatment voltage and time on the Sulforaphane content of broccoli sprouts

2.2 等离子体处理对不同品种西兰花芽苗发芽情况及活性物质含量的影响

选取最优等离子处理条件电压为30 V，时间为2 min测定不同品种西兰花芽苗生物活性指标。由表2可知，等离子体处理与对照处理不同品种西兰花芽苗发芽率、芽长和芽重呈现出不同的差异性。6个品种相比较，MTL发芽率最高，可达87.8%。LBS未经等离子体处理，芽长可达9.06 cm，芽重可达0.042 g。而等离子体处理2 min不同品种西兰花芽苗芽长无显著差异（P＞0.05），但等离子体处理2 min不同品种西兰花芽苗与对照处理相比，芽长芽重均有所提高。WX经等离子体处理2 min后，较对照相比芽长增加了24.6%；芽重增加了26.7%。

表2 等离子体处理对不同品种西兰花芽苗影响Table 2 Effects of plasma treatment on sprouts of different varieties of broccoli

由图4可知，本研究中选取的6个品种的西兰花芽苗中的萝卜硫素和总硫苷含量有较大差异。其中MNL的萝卜硫素和总硫苷含量均显著高于其他5个品种（P＜0.05）。图4（A）表明，等离子体处理后，六个品种SF含量均显著提升，较未处理提高了17～85%，平均提高40.8%。图4（B）表明，等离子体处理后WX、MNL和LY品种芽苗总硫苷含量较对照处理均显著提高（P＜0.05），较未处理分别提高了27%、19%和41%；但MTL、LJ和LBS芽苗中的总硫苷含量较对照无显著差异（P＞0.05）。

由图5可以看出，MTL和LY品种总酚和总黄酮含量显著高于其他品种（P＜0.05），其他品种间无显著差异（P＞0.05）。WX、MNL、LY和LBS经等离子体处理后总酚和总黄酮含量均有所提高，但除了MNL的总黄酮含量外，等离子体处理对其他三个品种总酚和总黄酮含量影响并无统计学差异。MTL和LJ两个品种经等离子体处理后总酚和总黄酮含量显著降低（P＜0.05）。

由图6A可以看出，经等离子体处理后，WX和MNL的清除DPPH自由基能力较对照分别升高了28.4%和24.7%；图6B表明，MNL的Fe2+还原能力对照升高了14.4%（P＜0.05）；但等离子体处理也导致了MTL和LJ两个品种Fe2+还原能力的降低。其他品种经等离子体处理后清除DPPH自由基能力和Fe2+还原能力与对照无显著差异（P＞0.05）。

图 4 等离子体处理对不同品种西兰花芽苗SF（A）和GLs（B）含量影响Fig.4 Effects of plasma treatment on sulforaphane (A) and glucosinolates (B) content of different varieties of broccoli sprouts

图 5 等离子体处理对不同品种西兰花芽苗TP（A）和TF（B）含量影响Fig.5 Effects of plasma treatment on total phenols (a) and total flavonoids (b) content of different varieties of broccoli sprouts

图 6 等离子体处理对不同品种西兰花芽苗抗氧化指标的影响Fig.6 Effects of plasma treatment on the antioxidant indexes of different broccoli sprouts

3 讨论

等离子体是一个复杂的物理态，其处理可能对种子产生积极和消极的影响。等离子体对种子萌发的影响因素被证实的主要是刻蚀作用[15]，不同种子的敏感度不同，不同的处理条件也会出现不一样的效果[16]。在合适的电压和处理时间内对西兰花种子进行处理能有效地改善其种子萌发、生长发育的速度。WX在被处理后，其发芽率相较未处理有增有减。等离子体处理时间为2 min时，发芽率、芽长和芽重均为最高值。Kim等[11]研究等离子体处理种子1或2 min对芽苗的重量和长度有积极影响。当等离子体处理条件适当，经过处理后，种子的通透性得到提高，也会增加其亲水性而改善生根且处理后增强了其吸涨作用，种子会很快从外界获取营养[17]。所以确定适当的等离子体处理参数，对种子的生物活性物质含量影响起着关键性作用。西兰花芽苗中萝卜硫素含量随等离子体处理时间增大而先升高后降低，主要是因为当种子遭受一定的胁迫，萝卜硫素作为植物中重要的次生代谢产物，其含量会得到积累；但是当胁迫作用到一定程度后，次生代谢产物含量不会继续增加[18-19]。30 kV 2 min等离子体处理后萝卜硫素含量提高了6.75倍，达到3.24 mg/g DW。这可能是由于低温等离子体的照射激活了种子中与萝卜硫素合成相关的酶的活性，例如支链氨基酸转移酶和细胞色素P450氧化酶活性[20]，从而显著增加萝卜硫素的含量，且等离子体处理能够加速种子体内蛋白酶的转化，激活种子的生命力，这也有助于增加萝卜硫素的富集量[10-11]。

不同品种的种子经等离子体处理后，会表现出不同的敏感度[21]。等离子体对某些种子具有一定的胁迫作用，MNL和LY经等离子体处理后抑制了种子萌发和生长发育。等离子体处理不同品种西兰花种子，萝卜硫素含量较对照处理均显著提高（P＜0.05），但MTL、LJ两个品种的硫苷含量显著低于对照处理（P＞0.05），其原因可能是MTL和LJ中黑芥子酶活性较高，抑制了萝卜硫苷向萝卜硫素的转化或经等离子体处理后加快了ESP蛋白的失活，抑制了萝卜硫苷向萝卜硫腈的转化，从而提高萝卜硫素含量。Guo[1]等人研究也表明，不同品种西兰花的萝卜硫素和总硫苷含量也存在差异, 研究了10个品种的西兰花种子中萝卜硫素与总硫苷含量为0.12～11.37 mg/g DW和7.11～134.06 μmol/g DW。

总酚与总黄酮是西兰花芽苗菜中重要的抗氧化物质,不同品种间抗氧化物质含量经过等离子体处理后存在差异性，WX、MNL、LY和LBS经等离子体处理后抗氧化物质显著升高（P＜0.05），这可能是由于等离子体处理改变了不同种基因型产生抗氧化物质的能力和接受环境能力[22-24]。且本研究中WX、MNL、LY和LBS经等离子体处理后清除DPPH自由基能力和Fe2+还原抗氧化能力也显著升高（P＜0.05）。据报道，芽苗中的茉莉酸甲酯能显著增加总酚类含量，从而能提高DPPH的自由基清除能力[25-26]。与Kim等[27]研究结果一致：1 mmol/L外源茉莉酸甲酯处理萝卜芽苗TPC含量相比对照提高41%，且清除DPPH自由基能力显著提高。而MTL与LJ的总酚、总黄酮含量、清除DPPH自由基能力和Fe2+还原抗氧化能力经等离子体处理与对照相比显著降低（P＞0.05），表明等离子体处理对西兰花芽苗菜也可能造成一定的胁迫效应，总酚、总黄酮含量的增加与抗氧化能力的增加之间也存在类似的相关性[27],使酚类物质得到积累以抵御胁迫[28-30]。

4 结论

西兰花芽苗经等离子体处理后，其生长发育状态和活性物质含量受到显著影响。等离子体处理电压、时间对西兰花芽苗发芽状态及活性物质含量都有显著影响，在电压30 kV，处理时间2 min条件下，西兰花芽苗发芽5 d后芽长、芽重都有显著增加，萝卜硫素含量最高达到3.24 mg/g DW，较未处理提高了6.75倍。不同品种西兰花芽苗中萝卜硫素、总酚、总黄酮含量及抗氧化活性存在显著差异，其中MNL的萝卜硫素和总硫苷含量最高，而MTL和LY的总酚和总黄酮含量最高。等离子体处理WX、MNL、LY和LJ的总酚和总黄酮含量及抗氧化能力较对照处理均有所提高。这些结果表明等离子体处理可实现西兰花芽苗中萝卜硫素等活性物质的富集，提高其生物学功效，降低萝卜硫素等获取成本，在食品工业中显现出了极大的应用潜力。