肾衰宁片对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的改善作用及机制研究

马 飞，刘 琳

(1.锦州医科大学附属第三医院肾脏内科，辽宁 锦州 121002；2.赤峰市医院血液净化中心，内蒙古 赤峰 024099)

肾间质纤维化(Renal interstitial fibrosis，RIF)作为各种肾脏疾病发展终末阶段，最终导致终末期肾脏病(End stage renal disease，ESRD)，只能接受肾脏替代疗法，因此已经成为一个日益严重的问题。RIF是慢性肾衰竭(Chronic renal failure，CRF)呈进行性发展的始动因素，表现出肾小管间质纤维化(Tubulo interstitial fibrosis，TIF)及肾小球硬化的病理特征[1-2]。在此基础上各种肾脏损伤后的肾小管是如何触发成纤维细胞活化已成为该领域研究的热点问题。Wnt信号功能缺陷可能导致各种人类疾病，如生长发育异常和肿瘤[3]。目前已经发现在RIF中起关键作用的Wnt信号传导通路蛋白和相关基因[4]，这可能为抗RIF治疗的设计提供新的突破口。肾衰宁片主要用于治疗慢性肾脏病(Chronic kidney disease，CKD)，且疗效已被证实[5]。然而，对其如何发挥延缓RIF的作用机制尚不清楚。鉴于此，本研究观察肾衰宁片对单侧输尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction，UUO)大鼠肾脏功能指标、蛋白尿水平、肾脏病理以及Wnt1、β-catenin的影响，为今后该类疾病的临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级Wistar雄性大鼠45只[许可证号：SCXK(京)2019-0010]，体重180～220 g，月龄为6～8周，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司。本研究经伦理委员会审核和批准。

1.2 主要试剂 肾衰宁片(国药准字Z20060030)购于山西德元堂药业有限公司；兔抗大鼠Wnt1单克隆抗体(批号：AF5315)购于Santa Cruz公司；羊抗大鼠β-catenin单克隆抗体(批号：51067-2-AP)购于Proteintech公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组与模型制备：将45只健康大鼠随机分成假手术组(S组)、模型组(U组)和治疗组(T组)，每组15只。U组及T组大鼠选择右侧肾盂和输尿管交界区下2 cm处进行手术结扎，以造成右侧肾脏积水模型。S组常规进行手术，不结扎右侧输尿管。

1.3.2 给药方法：T组从术后第1日起给予肾衰宁片0.19 g/(kg·d)进行灌胃，S组和U组每日给予相同容量的0.9%氯化钠溶液进行灌胃。

1.3.3 标本收集：三组大鼠在术后7、14、21 d分别处死5只。各组大鼠处死前1 d通过反射排尿法收集尿液并保存待查。取血后立即处死大鼠，在无菌条件下快速解剖出大鼠的右肾，用0.9%氯化钠溶液冲洗干净，用纱布吸干表面水分。经冠状纵切口保存大鼠约1/4的全肾组织。标本肾组织采用10%福尔马林溶液中固定，然后脱水、石蜡包埋、切片(厚度要求3～4 μm)，进行肾病理形态学、血液检测和免疫组化染色。

1.4 观察指标

1.4.1 血、尿指标检测：采用生化检测仪检测血清肌酐(CREA)和尿素氮(BUN)。应用定量法检测尿微量白蛋白(mAlb)。

1.4.2 肾脏病理形态：在400倍光镜下选取10个肾实质视野，分别计算各个视野的评分，取平均值。HE染色后进行结果判定，根据分布情况进行RIF病变严重程度评分[6]。

1.4.3 胶原容积分数(CVF)：Masson染色后，RIF病变越重，肾间质蓝色胶原沉积越重，并且着色越鲜亮。于400倍光镜下选择10个肾实质视野，计算胶原阳性的蓝色面积与总面积的百分比，即CVF。

1.4.4 Wnt1和β-catenin表达情况：免疫组化染色后，阳性区域为棕黄色，颜色越重代表表达越明显，核为浅蓝色。在图像分析系统的帮助下，利用光学显微镜采集切片图像，随机选取10个高倍镜(400倍)视野，采用Image J软件计算Wnt1和β-catenin的平均光密度(AOD)。

2 结 果

2.1 三组大鼠术后不同时间点血清CREA、BUN及尿mAlb水平比较 见图1。术后7、14、21 d，U组血清CREA、BUN水平显著高于S组和T组，且T组高于S组(均P<0.05)。术后7、14 d，三组大鼠尿mAlb水平比较差异无统计学意义(均P>0.05)。随着梗阻时间延长，术后21 d三组尿mAlb水平出现显著变化，S组尿mAlb水平最低，T组次之，U组最高，三组比较差异有统计学意义(均P<0.05)。

注：与S组比较，*P<0.05；与U组比较，#P<0.05

2.2 肾组织病理学改变

2.2.1 肾组织形态肉眼观察：S组肾外形正常，大小正常，外观呈暗红色，各时间点均无明显变化；术后7 d，U组和T组病侧肾外形增大、肿胀，外观颜色逐渐变淡，肾实质厚度变薄；术后14 d， U组和T组病侧肾进一步增大，外观颜色变淡，肾积液，肾实质厚度进一步变薄；术后21 d，U组和T组病侧肾外形体积明显增大，外观颜色进一步变淡，肿胀明显，肾积液加重，肾实质厚度更薄。

2.2.2 肾组织HE染色结果：见图2。S组肾小管上皮细胞(RIEC)基本正常。术后7 d， U组和T组RIEC轻度萎缩及坏死，空泡变性，炎症细胞在肾间质局灶性浸润，RIEC刷状边缘脱落，肾间质出现轻度纤维化；术后14 d，U组和T组RIEC中度萎缩，空泡变性范围增大，坏死，炎症细胞在肾间质仍呈弥漫性浸润，肾间质中度纤维化；术后21 d，U组和T组病变更为严重，RIEC严重萎缩，重度坏死，伴有大量炎症细胞，肾间质胶原纤维增生明显，RIF显著。统计学分析显示，U组及T组大鼠RIF病变严重程度评分明显高于S组(均P<0.01)；与U组比较，T组各时间点RIF病变严重程度评分降低，但仍高于S组(均P<0.05)。见表1。

图2 三组大鼠术后不同时间点肾组织病理学变化(HE染色，×400)

表1 三组大鼠术后不同时间点RIF病变严重程度评分比较(分)

2.3 三组大鼠肾间质CVF比较 见表2。Masson染色结果显示，S组大鼠肾间质基本正常，各时间点无明显变化；U组和T组蓝染纤维化主要出现在小管的间质区。术后7、14、21 d，U组和T组肾间质CVF高于S组，且随梗阻时间推移CVF呈进行性增高(均P<0.05)。T组术后各时间点CVF高于S组，但低于U组(均P<0.05)。

表2 三组大鼠肾间质CVF比较(%)

2.4 三组大鼠肾组织Wnt1和β-catenin AOD比较 见表3。免疫组化染色结果显示，S组Wnt1和β-catenin表达呈阴性，U组和T组表达呈阳性，为深黄色，并且在肾小管上皮细胞和间质细胞上呈现强阳性表达，多为褐色。采用Image J软件计算Wnt1和β-catenin的AOD后进行比较，S组最低，且术后各时间点AOD比较差异无统计学意义(均P>0.05)。U组和T组AOD高于S组，且随梗阻时间推移AOD呈进行性增高(均P<0.05)。T组术后各时间点AOD高于S组，但低于U组(均P<0.05)。

表3 三组大鼠肾组织Wnt1和β-catenin AOD比较

3 讨 论

RIF是许多不同原因引起CKD的共同病理学最终结果，其中Wnt/β-catenin信号传导通路在RIF的进展中起着关键作用并逐渐被认识[7-9]。由于目前的治疗方法疗效有限，研发针对参与RIF发病机制的关键分子途径的新药物来阻止其进展仍是一项艰巨任务。抑制RIF是CKD的主要治疗方向，虽然临床治疗取得了一定效果，但对Wnt/β-catenin信号传导途径的研究较少。

在本研究中过程中，我们系统收集了血清CREA和BUN、尿mAlb以及肾脏病理结果，发现三组大鼠尿mAlb水平在术后7、14 d无显著变化，但随着梗阻时间延长，术后21 d三组尿mAlb水平出现显著变化，S组尿mAlb水平最低，T组次之，U组最高，可见肾衰宁片对终末期肾脏病的蛋白尿控制有一定作用，从而发挥保护肾脏功能的作用。肾脏功能方面检查发现在各个时间点U组及T组大鼠血清CREA、BUN均显著高于S组，血清CREA、BUN进行性升高，提示肾功能进一步恶化，但T组仍能反映出肾衰宁片具有明显的肾脏保护作用，可以降低血清CREA、BUN。肉眼观察肾脏大体标本发现，S组外观无明显异常，各个时间点也无明显异常变化，但在U组及T组肾脏体积逐渐肿胀。HE染色发现，S组肾脏病理无明显变化，但偶有炎症细胞轻度浸润，考虑这种轻度变化与手术应激相关，U组及T组术后7 d开始逐渐出现炎症细胞浸润并伴有轻度纤维化，术后14 d大量炎症细胞浸润并出现中度纤维化，伴有小管坏死、萎缩，术后21 d病变进一步加重；通过对RIF进行病理评分发现，在各时间点T组病理损伤程度均比U组轻。Masson染色发现，蓝染肾间质胶原纤维在U组和T组术后7 d时开始出现，并随着时间延长，蓝染面积逐渐扩大，统计学分析发现U组CVF最高，T组次之，S组最低，提示T组肾间质纤维化程度相较于U组明显改善，说明肾衰宁片能减轻RIF病理变化，发挥肾脏保护作用，同时也能控制终末期肾脏病蛋白尿。

Wnt信号通路的功能主要体现在有节律地处于静止及活化状态，在这个过程中产生的糖脂蛋白物质可诱导正常组织细胞进行新陈代谢，参与组织代谢过程中的细胞增殖和凋亡[10-11]。正常情况下，肾脏中Wnt/β-catenin信号途径处于静态状态，但当β-catenin持续积累时，Wnt信号通路被活化，导致大量炎症细胞浸润、增殖和分化[12-13]。因此，下调Wnt/β-catenin信号通路活性可在一定程度上抑制RIF的进展，达到保护肾功能的作用。Wnt1和β-catenin的表达在术后7、14、21 d逐渐增多，输尿管梗阻引起Wnt/β-catenin明显表达，主要表现在肾小管上皮。免疫组化染色结果发现，Wnt1和β-catenin表达呈现正相关，肾衰宁片可能是通过独立于体内的这种信号通路的激活和中断而干预这一机制来发挥其抗纤维化作用的。当然，RIF除了Wnt/β-catenin的激活，还受到其他信号通路的调控，最近的研究提出了几种不同程度干扰Wnt信号的方法。Wnt拮抗剂Dapper3的缺失可导致UUO模型中β-catenin的聚集、Wnt靶向的促纤维化基因的激活和纤维化表型的恶化[14-15]。除了基因调控外，干扰Wnt信号的小分子也可以调节纤维化的发展，因此可能成为治疗纤维化的新途径[16]。例如，维生素D对肾间质纤维化有保护作用，其主要是通过对降钙素与T细胞因子4(TCF-4)竞争β-catenin来抑制Wnt/β-catenin信号传导[17]；ICG-001可抑制Wnt/β-catenin活性，同样也能减缓RIF的发生及发展过程[18]。研究[19]发现，黄芪可以通过影响Wnt信号通路延缓RIF进程，从而减轻肾脏病变，保护肾脏机能。此外，有研究[20]报道黄精皂苷可以抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化，从而抑制TIF的进展，最终达到保护肾脏的效果。

综上所述，肾衰宁片可改善UUO大鼠RIF程度，保护肾功能，降低尿mAlb水平，其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关，选择性抑制Wnt/β-catenin信号通路可能为纤维化肾病的治疗提供新的策略。但本研究仅仅是针对动物模型的有效性研究，药物用于临床是否有效还需要在未来做大量的研究加以验证。