冷缺血时间与胆道闭锁肝组织RNA质量的相关性分析

马婷婷，曹磊，王建喜，毕森盛，段可然，冯湛，毕博文，王政禄，郑虹

·论著·

冷缺血时间与胆道闭锁肝组织RNA质量的相关性分析

马婷婷，曹磊，王建喜，毕森盛，段可然，冯湛，毕博文，王政禄，郑虹

分析冷缺血时间与胆道闭锁肝组织样本中 RNA 浓度、纯度及完整性（RIN）的相关性，为获得高质量肝组织样本提供标准。选取天津市第一中心医院 30 例因胆道闭锁行肝移植术患者的肝组织，室温放置 0、0.25、0.5、1、2、3、5 和 12 h 后分别加入 RNAlater，4 ℃过夜，提取总 RNA，检测 RNA 浓度、纯度及 RIN 值，根据浓度计算出产量，运用单因素方差分析分析冷缺血时间与胆道闭锁肝组织样本中 RNA 产量、纯度及 RIN 值的相关性，典型相关分析分析不同冷缺血时间后组织样本 RNA 产量、纯度及 RIN 值之间相关性。组织样本冷缺血 0、0.25、0.5、1、2、3、5 和 12 h 后，每10 mg 组织样本的RNA 产量分别是（9.123 ± 0.530）、（9.220 ± 0.606）、（9.000 ± 0.862）、（9.067 ± 0.498）、（9.027 ± 0.523）、（9.143 ± 0.627）、（9.113 ± 0.446）和（9.193 ± 0.492）μg（= 0.78）。RNA 纯度的比值分别为1.914 ± 0.065、1.896 ± 0.060、1.904 ± 0.053、1.907 ± 0.057、1.896 ± 0.057、1.888 ± 0.050、1.908 ± 0.060 和 1.899 ± 0.059（= 0.74）。RIN 值分别为9.077 ± 0.104、8.777 ± 0.138、8.650 ± 0.187、8.197 ± 0.188、7.963 ± 0.227、7.597 ± 0.301、4.433 ± 0.272 和 3.747 ± 0.236（= 0.000）。单因素方差分析显示冷缺血时间与 RNA 的产量和纯度均无相关性，与 RIN 值显著相关。典型相关分析显示不同冷缺血时间后组织样本 RNA 产量与纯度、产量与 RIN 值及纯度与 RIN 值之间均无相关性。冷缺血时间与胆道闭锁肝组织 RNA 质量具有显著相关性，缩短冷缺血时间可获得高质量 RNA。

冷缺血时间； 胆道闭锁； 肝组织； RNA 质量； RNA 完整性

组织样本是临床诊断和科学研究中应用广泛的生物样本资源之一，组织质量的评估主要从 DNA、RNA、蛋白质及形态学等方面进行评价，其中 DNA、蛋白质及形态学等因素评估组织质量变化趋势往往不敏感，而 RNA 的质量鉴定可以很好地反映组织样本的质量[1-2]。以往研究表明，不同组织样本 RNA 的质量研究不尽相同，并且缺血时间与 RNA 的质量具有一定的相关性[3]。然而，不同冷缺血时间点下组织样本 RNA 降解趋势及程度还不清楚。因此，我们选取不同冷缺血时间点对胆道闭锁肝组织 RNA 的浓度、纯度及 RIN 值进行检测，以明确其与 RNA 质量的相关性。

胆道闭锁是发生于婴幼儿时期的一种少见胆道疾病，其发病机制尚不清楚[4]。因此，该疾病的研究具有重大意义。组织样本作为珍贵的研究资源和疾病研究的基础，只有保证样本的质量，才能保证疾病研究的科学性和客观性[5]。为此，本研究选取胆道闭锁肝组织样本进行冷缺血时间与 RNA 质量的相关性探究。

1 材料和方法

1.1 材料

Airstream®A2 型二级生物安全柜（AC2-4S1）购自新加坡Esco 公司；HHS-21-6 型电热恒温水浴锅购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；1-14K 台式高速冷冻离心机购自德国 Sigma 公司；TP-24 组织快速破碎仪购自杰灵仪器制备（天津）有限公司；GL-1900 干式恒温器购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司；ND5000 超微量紫外可见光分光光度计购自北京百泰克生物技术有限公司；4200 TapeStation 生物分析仪、RNA ScreenTape（批号：0201995-87）、RNA ScreenTape Sampie Buffer（批号：0006562819）均购自美国Agilent 公司；RNAlater（批号：01025057）购自美国 Thermo Fisher 公司；RNA 提取试剂盒（批号：W9129）购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 组织样本采集 选取天津市第一中心医院因胆道闭锁行肝移植术的患者 30 例，其中男 18 例，女 12 例，年龄 5 ～ 12 个月，中位年龄（6.8 ± 1.095）个月，所有患者家属均签署知情同意书，实验通过天津市第一中心医院伦理委员会批准。全肝组织离体后收集患者标本，于生物安全柜内，用无菌无酶的剪刀剪取若干份，每份约 10 mg，分别放入无菌无酶的冻存管中，室温放置 0、0.25、0.5、1、2、3、5 和 12 h 后加入RNAlater置于4 ℃过夜，储存于–80 ℃冰箱。

1.2.2 组织样本 RNA 的提取 RNA提取试剂盒提取组织样本中总 RNA：组织样品 10 mg，加入裂解液 RL（含 β-巯基乙醇），组织研磨机研磨，56 ℃温育10 min，取上清液，加入 0.5 倍体积无水乙醇，加入 RNA 离心柱中，离心，弃液体。加入洗脱液，离心，弃液体。加入DNase I 工作液，室温放置 15 min。加入洗脱液，离心，弃液体。干燥离心柱，无 RNase 水洗脱 RNA。

1.2.3 组织样本 RNA 的检测

1.2.3.1 RNA 产量及 RIN 值检测 生物分析仪检测 RNA 浓度及完整性，根据浓度计算出产量。按操作说明书进行，取 1 μl RNA 样本加入缓冲液5 μl/孔，70 ℃变性 2 min，冰上放置 5 min 后检测。

1.2.3.2 RNA 纯度检测 分光光度计测定 RNA 纯度，DEPC 处理水校正零点，吸取 1 μl RNA 滴到紫外分光光度计上，读取260/280比值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 不同冷缺血时间后胆道闭锁肝组织 RNA 产量

10 mg 胆道闭锁肝组织在 0、0.25、0.5、1、2、3、5 和 12 h 的冷缺血时间后提取 RNA 的产量分别是（9.123 ± 0.530）、（9.220 ± 0.606）、（9.000± 0.862）、（9.067 ± 0.498）、（9.027 ± 0.523）、（9.143 ± 0.627）、（9.113 ± 0.446）和（9.193 ± 0.492）μg。不同冷缺血时间后组织 RNA 的产量无统计学差异（= 0.78）。

2.2 不同冷缺血时间胆道闭锁肝组织 RNA 纯度

组织样本在 0、0.25、0.5、1、2、3、5 和12 h 的冷缺血时间后，260/280的比值分别为 1.914 ± 0.065、1.896 ± 0.060、1.904 ± 0.053、1.907 ± 0.057、1.896 ± 0.057、1.888 ± 0.050、1.908 ± 0.060 和 1.899 ± 0.059，比值介于 1.8 ～ 2.0 之间，但无统计学差异（= 0.74）。

2.3 不同冷缺血时间后胆道闭锁肝组织 RNA 完整性

30 例胆道闭锁肝组织在 0、0.25、0.5、1、2、3、5 和 12 h 的冷缺血时间后，RNA 的 RIN 值分别为9.077 ± 0.104、8.777 ± 0.138、8.650 ± 0.187、8.197 ± 0.188、7.963 ± 0.227、7.597 ± 0.301、4.433 ± 0.272和3.747 ± 0.236，差异具有统计学意义（= 0.000），冷缺血 3 h 胆道闭锁肝组织 RNA RIN 值大于 7，说明样本 RNA 的质量可满足大部分实验要求。冷缺血 5、12 h 组织样本 RNA RIN 值下降至 7 以下，在 5 h 时下降尤为明显（图 1）。

图1 不同冷缺血时间胆道闭锁肝组织RIN 值（n = 30，*P= 0.000）

Figure 1 The RIN of hepatic tissues in biliary atresia after different cold ischemia time (n = 30,*= 0.000)

如图 2 所示，样本冷缺血 0 ～ 3 h，胆道闭锁肝组织样本 RNA 的 28S 和 18S条带较完好。冷缺血 2 h 和 3 h 的样本出现小片段杂带，表明 RNA 具有小片段降解。冷缺血 5 h 和 12 h 样本出现大片弥散状，说明 RNA 被降解严重。图 3-1 显示 28S 峰值区域约为 18S 峰值区域的 1.8 倍，且杂带较少，说明组织细胞 RNA 较完好。图 3-8 显示 28S 峰值区域和 18S 峰值区域融合，在 18S 的左侧、18S 和 28S 的中间以及 28S 的右侧区域均有不同大小的峰，表明 RNA 被严重降解。

L：Ladder；1：冷缺血 0 h；2：冷缺血 0.25 h；3：冷缺血 0.5 h；4：冷缺血 1 h；5：冷缺血 2 h；6：冷缺血 3 h；7：冷缺血 5 h；8：冷缺血 12 hL: Ladder; 1: Cold ischemia 0 h; 2: Cold ischemia 0.25 h; 3: Cold ischemia 0.5 h; 4: Cold ischemia 1 h; 5: Cold ischemia 2 h; 6: Cold ischemia 3 h; 7: Cold ischemia 5 h; 8: Cold ischemia 12 h

Figure 2 BioAnalyzer simulated electrophoretogram

2.4 不同冷缺血时间组织样本 RNA 产量、纯度和 RIN 值相关性分析

典型相关分析显示，随着缺血时间的延长，组织样本产量与纯度，产量与 RIN 值以及纯度与 RIN 值之间均无相关性（表 1 ～表 3）。

3 讨论

在基因组时代，组织样本被认为是生物、临床和转化医学研究的宝贵资源。高质量的生物样本可为医学科学研究提供可靠的数据来源[6]。生物样本质量往往从 DNA、RNA 和蛋白等方面对样本进行评价，而 RNA 在样本的收集、处理、存储过程中更易降解，因此 RNA 的质量更能体现样本的质量情况，并可作为衡量样本质量的标准。倪雅楠等[7]从 DNA、RNA、组织切片病理形态三个方面比较反复冻融后胃、胰腺、肝、结肠等肿瘤组织样本分子水平与形态的变化，发现冻融后组织样本 DNA 与病理形态未受影响，而 RNA 的纯度、浓度均降低，RNA 发生不同程度的降解。Song 等[8]对在液氮储存 1 ～ 6 年的肝、胃等肿瘤组织进行质量评估，通过检测 RNA 的质量发现，储存时间对肿瘤组织的质量无影响。本研究从 RNA 的质量方面对离体后不同冷缺血的胆道闭锁肝组织质量进行评估，发现冷缺血 3 h，RNA 的 RIN 值有所下降，组织样本存在不同程度降解，但 RIN 值均大于 7。说明在冷缺血 3 h 内，胆道闭锁肝组织 RNA 降解程度不大，均可满足各类下游实验需求。然而，其他疾病类型的肝组织样本是否受冷缺血时间影响还未可知，需要下一步继续研究。本实验选取30 例胆道闭锁患者进行研究，可能存在一定的局限性，但在疾病本身发生率低的背景下，尽可能多地收集胆道闭锁肝组织样本进行样本质量的研究，以保证实验结果的客观性与准确性，从而为收集高质量的组织样本提供依据，进而为科研及临床工作者研究胆道闭锁发病机制打下科学基础。

组织采集保存过程中的冷缺血时间主要是指组织离体后到储存前的时间，冷缺血时间是影响组织样本质量的重要因素。Hatzis 等[9]将术后乳腺癌组织经历 40、60、120 和 180 min 的冷缺血后检测样本 RNA RIN 值，发现冷缺血 180 min 后 RNA 的RIN 值有下降趋势，但各组间无统计学差异。Matsubara 等[10]将 40 例离体后的肺癌组织分别室温放置 0、50、100 和 150 min 后检测 RIN 值，结果发现，不同冷缺血组间 RNA 的 RIN 值无统计学差异，150 min 的冷缺血时间不影响肺癌组织 RNA 质量。本研究通过对以往文献的阅读，选取了 0、0.25、0.5、1、2、3、5 和 12 h 8 个冷缺血时间点对 RNA 质量进行检测，发现随着冷缺血时间的延长 RIN 值有下降的趋势，具有统计学差异，但 RIN 值均大于 7。说明 RNA 存在一定的降解，但总体 RNA 的质量良好，可满足不同实验需求。

图3 RNA 电泳图分析（1：冷缺血 0 h；2：冷缺血 0.25 h；3：冷缺血 0.5 h；4：冷缺血 1 h；5：冷缺血 2 h；6：冷缺血 3 h；7：冷缺血 5 h；8：冷缺血 12 h）

Figure 3 RNA electrophoretogram analysis (1: Cold ischemia 0 h; 2: Cold ischemia 0.25 h; 3: Cold ischemia 0.5 h; 4: Cold ischemia 1 h; 5: Cold ischemia 2 h; 6: Cold ischemia 3 h; 7: Cold ischemia 5 h; 8: Cold ischemia 12 h)

表1 不同冷缺血时间组织样本产量与纯度相关性分析

Table 1 Correlation analysis between yield and purityof tissue samples at different cold ischemia time

冷缺血时间（h）Cold ischemia time (h)相关CorrelationP值P value 00.8370.688 0.250.7210.947 0.50.6110.989 10.5110.997 20.3640.999 30.1880.999 50.0850.994 120.0650.769

注：采用典型相关分析。

Note: Canonical correlations was used.

表2 不同冷缺血时间组织样本产量与 RIN 值相关性分析

Table 2 Correlation analysis between tissue sample yield and RIN at different cold ischemia time

冷缺血时间（h）Cold ischemia time (h)相关CorrelationP值P value 00.7590.786 0.250.6790.876 0.50.6580.903 10.5110.960 20.3780.950 30.3510.849 50.2860.710 120.1380.531

注：采用典型相关分析。

Note: Canonical correlations was used.

表3 不同冷缺血时间组织样本纯度与 RIN 值相关性分析

Table 3 Correlation analysis between purity and RIN of tissue samples at different cold ischemia time

冷缺血时间（h）Cold ischemia time (h)相关CorrelationP值P value 00.7220.999 0.250.6231.000 0.50.4151.000 10.3351.000 20.2850.999 30.2190.986 50.1830.862 120.1700.439

注：采用典型相关分析。

Note: Canonical correlations was used.

RNA 质量的评价标准主要是浓度、纯度及 RIN 值，RNA 浓度主要利用260 nm 处的吸光度值评价，260= 1 相当于 RNA 的质量浓度为40 μg/ml[11]。研究表明，RNA 的浓度与降解程度具有一定的相关性，RNA 浓度越低，其降解速度越快[12]。在本研究中发现不同冷缺血时间与 RNA 的产量无统计学差异。而样本经历更长时间冷缺血后是否影响 RNA 的产量后续会进一步探究。RNA 纯度主要利用260/280来估计。通常纯制品 RNA 的260/280为 1.8 ～ 2.0，若比值偏低，则代表有蛋白或其他有机物的污染；若比值偏高，代表RNA 已经水解成单核酸，RNA 提取失败。本研究检测不同冷缺血后的 30 例胆道闭锁肝组织 RNA 纯度，260/280均在1.8 ～ 2.0，说明RNA 提取成功。目前，RNA 的质量已被用作组织质量评估标准，而完整性是评价 RNA 质量的重要因素。安捷伦生物分析仪分析的 RIN 值为广泛认可的 RNA 完整性测量方法，优于传统的将核糖体比率 28S/18S 作为评价标准的方法。安捷伦生物分析仪具有高度的可重复性和自动化，通过显示 RNA 片段大小分布的详细画面（前区、5S 区、快速区、中区、前体区、后区、18S 和 28S）可提供更好的 RNA 完整性评估结果。本实验采用生物分析仪 4200 对离体后胆道闭锁肝组织 RNA 质量进行检测，在当前的科研水平下，最大限度保证了实验的准确性、科学性。

综上所述，不同冷缺血时间对胆道闭锁肝组织样本中 RNA 产量、纯度无相关性，而对 RIN 值显著相关。随着冷缺血时间的延长，组织样本的产量、纯度与 RIN 值之间均无相关性。胆道闭锁肝组织在 3 h 的冷缺血时间内 RNA 质量良好。本研究为制订规范的肝样本采集流程和规范提供科学依据，提高肝组织样本保存质量。

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Correlation between cold ischemia time and RNA quality in hepatic tissue of biliary atresia

MA Ting-ting, CAO Lei, WANG Jian-xi, BI Sen-sheng, DUAN Ke-ran, FENG Zhan, BI Bo-wen, WANG Zheng-lu, ZHENG Hong

To analyze the correlation between cold ischemia time and RNA concentration, purity and RNA integrity number (RIN) in hepatic tissue samples of biliary atresia, so as to provide a standard for obtaining high-quality hepatic tissue samples.Thirty patients with biliary atresia undergoing liver transplantation in the Tianjin First Central Hospital were selected. After removal of the hepatic tissue, RNAlater reagent was added at room temperature for 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 5 and 12 h. Total RNA was extracted, and the concentration, purity (260/280) and RIN were detected. The yield was calculated according to the concentration. One way ANOVA was used to analyze the correlation between cold ischemia time and RNA production, purity and RIN in hepatic tissue samples of biliary atresia. Canonical correlation was used to analyze the correlation between RNA production, purity and RIN in tissue samples after different cold ischemia time.The RNA yields (µg/10 mg) of the tissue samples after 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 5, and 12 h at room temperature were 9.123 ± 0.530, 9.220 ± 0.606, 9.000 ± 0.862, 9.067 ± 0.498, 9.027 ± 0.523, 9.143 ± 0.627, 9.113 ± 0.446 and 9.193 ± 0.492, respectively(= 0.78). The respective RNA purities (260/280) were 1.914 ± 0.065, 1.896 ± 0.060, 1.904 ± 0.053, 1.907 ± 0.057, 1.896 ± 0.057, 1.888 ± 0.050, 1.908 ± 0.060 and 1.899 ± 0.059 (= 0.74). The RNA integrity number (RIN) were 9.077 ± 0.104, 8.777 ± 0.138, 8.650 ± 0.187, 8.197 ± 0.188, 7.963 ± 0.227, 7.597 ± 0.301, 4.433 ± 0.272 and 3.747 ± 0.236 (= 0.000). The results from one way ANOVA showed that there existed no correlation of cold ischemia time with RNA yield and purity, but a significant correlation with RIN. The results from canonical correlation analysis showed that there was no correlation between RNA yield and purity, yield and RIN, purity and RIN after different cold ischemia time.There is a significant correlation between cold ischemia time and RNA quality in liver tissue of biliary atresia. Shortening cold ischemia time can obtain high-quality RNA.

cold ischemia time; biliary atresia; hepatic tissue; RNA quality; RNA integrity number

Biobank (MA Ting-ting, CAO Lei, WANG Jian-xi, BI Sen-sheng, DUAN Ke-ran, FENG Zhan, BI Bo-wen, WANG Zheng-lu, ZHENG Hong), Oriental Organ Transplant Center/Key Laboratory of Transplantation, Chinese Academy of Medical Sciences (ZHENG Hong), Tianjin First Central Hospital, Tianjin 300192, China

WANG Zheng-lu, Email: 13920474643@163.com; ZHENG Hong, Email: zhenghongxy@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2022.03.005

天津市第一中心医院春风项目（2019CF36）；天津市卫生健康委员会科技项目（ZC20065）

300192 天津市第一中心医院生物样本资源共享中心（马婷婷、曹磊、王建喜、毕森盛、段可然、冯湛、毕博文、王政禄、郑虹），东方器官移植中心/中国医学科学院移植重点实验室（郑虹）

王政禄，Email：13920474643@163.com；郑虹，Email：zhenghongxy@163.com

2022-01-05