永康地区耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药表型及分子分型分析

吕美艳 王丽之 胡苏球 应雄江 陈栎江

肺炎克雷伯菌被认为是引起医院获得性感染和社区获得性感染的主要肠杆菌科细菌之一，可引起呼吸道、尿道、手术部位软组织及血流感染等，严重者可危及生命[1]。国内于2007年首次在浙江发现质粒介导的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia,CRKP）[2]。随后，全国各地报道了CRKP检出情况[3-4]。近年来，随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛应用，CRKP检出率逐年上升，临床抗感染治疗形势越来越严峻[5]。近年来，永康市第一人民医院CRKP分离率明显升高；因此本研究对该院临床分离的CRKP临床分布特征、耐药表型、耐药基因型及分子分型进行分析，旨在为本地区临床CRKP抗感染治疗和院内感染防控提供依据。

1 对象和方法

1.1 对象 选取永康市第一人民医院2017年1月至2019年12月332例住院患者中分离到的332株非重复CRKP菌株为研究对象。质控菌株铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠埃希菌ATCC25922、产酸克雷伯菌ATCC700324均购自国家卫生部临床检验中心。

1.2 方法 随机选取30株CRKP菌株，采用改良Hodge试验、头孢他啶/阿维巴坦纸片扩散法、PCR法检测CRKP菌株耐药表型及基因型，采用多位点序列分型（multi-locus sequence typing,MLST）检测 CRKP菌株等位基因号及分子分型。

1.2.1 改良Hodge试验 将0.5 MCF的大肠埃希菌ATCC25922菌液均匀涂布于MH平板（批号：20200826B，郑州安图生物有限公司），中间贴上厄他培南药敏纸片（10 μg/片，批号：2953610，英国 Oxoid 公司），接种CRKP菌株；无菌接种环自纸片外缘向平板边缘划线，35℃孵育16～18 h后观察结果。结果判断：厄他培南抑菌圈内出现待检菌矢状生长为产碳青霉烯酶[6]。以经测序证实产KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌为阳性对照株，以产酸克雷伯菌ATCC700324为阴性对照株。

1.2.2 头孢他啶/阿维巴坦纸片扩散法 将0.5 MCF的CRKP菌液均匀涂布于MH平板，中间贴上头孢他啶/阿维巴坦药敏纸片（30 μg/片，批号：SK20，温州市康泰生物科技有限公司），35℃孵育16～18 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径，参照CLSI M100-S29头孢他啶标准判读CRKP菌株对头孢他啶/阿维巴坦的体外敏感性。

1.2.3 PCR检测 制备细菌DNA模板，参照文献[7]合成 blaKPC-2、blaIMP-1、blaVIM-1、blaOXA-48、blaNDM-1基因，引物序列见表 1。PCR 总反应体系 25 μl，包括 5 U/μl Taq DNA 聚合酶 0.3 μl、10×PCR buffer 2.5 μl、5 mmol/L dNTP mixture 1μl、待测菌 DNA 模板 2 μl、25 μmol/L下游引物 2 μl、25 μmol/L 下游引物 2 μl、ddH2O 15.2 μl。反应条件：94℃ 变性1 min；退火1 min，退火温度见表1；72℃延伸90 s。取10 μl PCR产物经含Goldview的20 g/L琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像仪（Chemi－DocXRS，美国Bio-Rad公司）观察并分析PCR产物的电泳条带；将阳性结果送上海桑尼公司进行测序，并与美国国家生物技术信息中心网站进行生物大分子序列比对，确定耐药基因型。

表1 目的基因引物序列及产物长度

1.2.4 MLST检测 根据选定的肺炎克雷伯菌7个管家基因（gapA、rpoB、mdh、pgi、phoE、infB、tonB，由上海桑尼生物公司合成）设计PCR扩增引物，使用PCR梯度扩增仪进行扩增，扩增条件：94℃变性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸30 s。扩增产物纯化后测定各位点片段的DNA序列，将拼接后的测序结果提交至Genbank，将7个管家基因序列与肺炎克雷伯菌MLST数据库（http://pubmlst.org/）相应等位基因进行比较，获得每个菌株的等位基因号，确定分子分型。

2 结果

2.1 CRKP菌株的患者性别、年龄、标本及科室来源分布 332株CRKP菌株来自男性患者239株（72.0%），女性患者93株（28.0%）；来自＞60岁患者246株（74.1%），21～60岁患者 74株（22.3%），＜20岁12株（3.6%）；标本来源主要为痰液233株（70.2%）、尿液63株（19.0%）、血液14株（4.2%）、排泄物9株（2.7%）；科室来源主要为 ICU 168株（50.6%）、呼吸内科病房 31株（9.3%）、神经外科病房27株（8.1%）。

2.2 CRKP菌株对抗菌药物的敏感性试验结果 CRKP菌株对复方新诺明、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星、四环素的敏感性较高，分别为71.9%、48.0%、38.6%、32.2%、31.7%；对亚胺培南、哌拉西林、美洛培南、氨苄西林/舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦的敏感性较低，分别为1.2%、4.5%、6.1%、7.9%、8.0%。

2.3 30株CRKP菌株耐药表型及基因型检测结果30株CRKP菌株的改良Hodge试验阳性率为90.0%（27/30）；对头孢他啶/阿维巴坦的体外敏感性为96.7%（29/30）；耐药基因型为 blaNDM-1仅 1株（3.3%），blaKPC-229株（96.7%），见表 2。

表2 30株CRKP菌株耐药表型及基因型检测结果

2.4 30株CRKP菌株等位基因号及分子分型 30株CRKP菌株中，分子分型为ST11型28株，占93.3%，见表3。

表3 30株CRKP菌株等位基因号及分子分型

3 讨论

近年来，全国CRKP检出率逐年升高，提示CRKP医院感染防控工作刻不容缓。因此，本研究对2017—2019年永康市第一人民医院临床分离的CRKP菌株进行分析，探讨其临床分布特征、耐药表型、耐药基因及同源性。本研究结果显示，332株CRKP菌株主要来源于ICU（占50.6%），感染患者的年龄普遍＞60岁（占74.1%），这与ICU患者高龄者较多有关，因为高龄患者往往合并较多基础疾病且免疫力低下[8]。此外，永康市第一人民医院患者中分离获得的CRKP菌株主要来源于痰液标本（占70.2%），提示CRKP主要通过呼吸道传播，与周开矿等[9]报道一致。本研究还发现永康市第一人民医院分离获得的CRKP主要来源于男性患者（占72.0%），与万玉香等[10]报道一致。

研究表明，CRKP对抗菌药物的耐药机制主要是产生碳青霉烯酶[11]。本研究结果显示，30株CRKP菌株的改良Hodge试验阳性率为90.0%；对头孢他啶/阿维巴坦的体外敏感性为96.7%，与耐药基因型检测结果（1株CRKP菌株携带blaNDM-1，29株CRKP菌株携带blaKPC-2）一致。这提示头孢他啶/阿维巴坦对产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌具有较好的抗菌作用。INFORM全球抗生素监测数据报告显示，在2014—2016年我国住院患者中，肺炎克雷伯菌对头孢他啶/阿维巴坦的体外敏感性达96.7%，与本研究结果基本一致。可见，头孢他啶/阿维巴坦纸片扩散法用于筛查CRKP具有较高的灵敏度和特异度。但由于本研究仅对30株CRKP菌株进行试验，具有一定的局限性，仍有待后续扩大检测数来进一步证实。此外，本研究还对30株CRKP菌株进行同源性分析，以确定院内感染可能的流行株。MLST是用于细菌同源性分析的常用方法[12-13]。本研究采用MLST技术检测细菌同源性发现，28株CRKP菌株为 ST11 型，占 93.3%，与 Liu 等[14]、Qi等[15]报道一致。

综上所述，CRKP是永康地区感染性疾病的重要病原菌，对多数抗菌药物具有高度耐药性，流行株为ST11型。建议本地区医疗机构根据这一流行特点，进一步加强医院感染预防与控制工作，比如严格加强感染患者隔离、医护人员卫生防护、医疗物品及环境空气消毒等措施，以预防CRKP传播。