嘉宝果不同发育期花果叶的挥发性成分分析

邱珊莲, 林宝妹, 郑开斌, 吴妙鸿, 洪佳敏

(福建省农业科学院亚热带农业研究所，福建 漳州 363005)

嘉宝果(Myrciaria cauliflora)，俗称树葡萄，为桃金娘科(Myrtaceae)拟香桃木属常绿灌木，原产于南美洲的巴西、玻利维亚、巴拉圭和阿根廷东部地区[1]，目前在我国福建、广东、海南、重庆等地均有种植，已成为国内一种新兴的热带水果。嘉宝果有很高的观赏及食药用价值，在巴西等原产地，嘉宝果的植株及果实广泛应用于园林、食品、医药保健品等领域。嘉宝果果实营养价值高，富含维生素C、抗坏血酸、钙、铁及多种氨基酸等营养成分[2]。嘉宝果植株各部位含有丰富的酚类物质，如黄酮类、花青素、单宁和酚酸等，具有很强的抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌的生物活性，其提取物在临床上用于治疗癌症、糖尿病、哮喘、腹泻等疾病[3]。果皮冻干粉直接添加入高血糖小鼠饮水中饲喂8 周后，发现大鼠血糖最高可降低19%，血浆中的血脂指标如甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白-胆固醇等含量均有显著降低[4]。饲料中添加8%的嘉宝果叶片粉末可极显著降低小鼠空腹血糖值和改善糖耐量[5]。关于嘉宝果植株各部位功效及活性成分方面的研究报道较多，但关于其花、果、叶挥发性成分的研究报道极少。植物挥发性成分是植物的次生代谢产物，具有缓解压力、促进细胞新陈代谢、镇静、镇痛、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等多方面药理活性[6-10]以及净化空气等多种生物活性，能直接或间接地保护人的身体和身心健康。挥发性成分主要分布于植物的花、叶、茎、果、根等部位，其释放成分的组成与植物种类、器官部位、生长阶段、生长环境等密切相关，从不同植物种类、不同器官部位、不同生长阶段检测到的挥发性成分构成及生物活性差异明显[11]。

嘉宝果是南美洲等地常见药食同源植物，其根、茎、叶、花、果均有很高的药用价值，尤其是花、果、叶中药用成分含量极高，其中易挥发性成分占有极其重要的比例[12]。本文以嘉宝果不同生长阶段的花、果、叶为试材，采用HS-GC-MS (顶空-气相色谱/质谱联用)技术，检测花、果、叶中的挥发性成分构成及相对含量，分析植株不同部位挥发性成分组成和释放规律，旨在筛选出具有积极作用的活性成分，并明确活性成分的富集部位和富集期，为嘉宝果植株的开发利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

以福建省农业科学院亚热带农业研究所国家闽台特色作物种质资源圃18 a 生的‘沙巴’嘉宝果(Myrciaria cauliflora)为试材，2021 年2 月18 日至3月1 日期间采集花苞和花，分为花苞期、初花期、盛花期和末花期4 个发育阶段。花芽膨大、但未开放时为花苞期；有5%的花朵开放为初花期；60%以上的花朵开放为盛花期；75%以上的花变黄时为末花期。3 月22 日至4 月15 日采集果实，分为青果期、红果期、完熟期和过熟期。嘉宝果果实发育历经青色、红色和紫黑色而成熟，果实膨大、果皮全绿为青果期，果皮由绿色全部转为红色、未变紫黑色为红果期，果皮黑且微软、果肉完全无涩味且甜味足为完全成熟期(完熟期)，果皮变皱、果肉甜味下降且出现酒味为过度成熟期(过熟期)。3 月15 日采集叶片，嫩叶为枝条顶部、质地柔嫩且叶脉不清晰者，叶片颜色为红色；老叶为枝条近树干侧、质地较硬且叶脉清晰者，叶片颜色为绿色。

TriPlus 300 顶空自动进样器(美国赛默飞公司)、Trace1300-TSQ 9000 气质联用仪(美国赛默飞公司)、JYS-M01 粉碎机(济南九阳股份有限公司)。

1.2 方法

样品制备称取当日采集的花苞或花3 g,尽快置于20 mL 的顶空瓶，放入顶空自动进样器中,瓶静态平衡3 min，炉温70 ℃。精选10 粒无机械损伤和病虫害果实，洗净，晾干水分后切块用粉碎机打成果浆，称取5 g 果肉置于20 mL 顶空瓶，瓶静态平衡5 min，炉温85 ℃。精选无病虫害的健康叶片经手揉搓3 min，称取3 g 尽快放入20 mL 的顶空瓶，瓶静态平衡3 min，炉温85 ℃。

GC-MS 检测花(苞)、叶片气相色谱分析条件：色谱柱，TG-5SILMS，30 m×0.25 mm×0.25μm石英毛细管柱；花(苞)、叶片程序升温：起始温度50 ℃，保持5 min，然后以5 ℃/min 升温到160 ℃，再以10 ℃/min 升温到250 ℃，保持5 min；进样量1 000μL，载气为He，体积流量1.2 mL/min，分流比10∶1。质谱条件：电离方式为EI，离子源温度300 ℃，接口温度280 ℃。扫描质量范围为30~550 amu。果实气相色谱程序升温：起始温度50 ℃，保持2 min，然后以8 ℃/min 升温到240 ℃，保持5 min；进样量1 000μL，载气为He，体积流量1.2 mL/min，不分流。质谱条件：电离方式为EI,离子源温度230 ℃，接口温度280 ℃。扫描质量范围为50~450 amu。

挥发性成分分析各组分质谱经NIST 检索,再人工谱图分析以确定各化学成分，采用峰面积归一法计算各成分相对含量。T/E 为萜烯类化合物相对含量/酯类化合物相对含量[13]；香气相似率参照王华夫等[14]的计算方法。

1.3 数据分析

通过SPSS 19.0 软件对试验数据进行单向方差分析、独立样本t检验及主成分分析。数据以均值±标准误差表示，多重比较采用 Duncan 法，以P<0.05为显著性差异。两个样本的比较采用t检验法。

2 结果和分析

2.1 花期挥发性成分组成

从嘉宝果花苞期、初花期、盛花期和末花期4个发育期的花(苞)中共检测出相对含量大于0.05%的化合物32 种，花苞期、初花期均含26 种，盛花期、末花期均含29 种，4 个花期共有的挥发性成分有22 种。由表1, 2 可知，整个花期挥发性成分包含萜烯类、酯类、醇类和其他化合物4 大类，整个花期均以萜烯类化合物为主体成分，含15~16 种化合物，相对含量68.78%~92.38%，末花期的相对含量(92.38%)显著高于盛花期(85.70%)，盛花期显著高于初花期(68.78%)和花苞期(71.95%)，后两者间无显著差异。酯类以初花期含量(16.95%)最高，显著高于花苞期(10.91%)，末花期含量仅有0.67%; 醇类化合物种类数及含量在花苞期(13.37%)和初花期(13.88%)不存在显著差异，前两个花期显著高于后两者；其他类化合物以盛花期含量(1.62%)最高，含3 种成分，其中邻异丙基甲苯含量为1.00%。

表1 嘉宝果花期的挥发性成分和相对含量Table 1 Volatile composition and relative contents of Myrciaria cauliflora at flowering stage

整个花期均以萜烯类化合物种类和含量最多,但各成分含量随发育期而明显变化(表2, 3)。萜烯类物质由单萜类和倍半萜类组成，整个花期单萜类占主导优势，各花期均有11 种单萜类成分，含量为66.89%~83.00%，成分种类和含量远大于倍半萜类，单萜类和倍半萜类含量均以末花期>盛花期>花苞期>初花期。单萜类的主要成分有α-蒎烯、β-蒎烯、D-柠檬烯和β-罗勒烯，在各发育期含量均>10%, 但各发育期含量存在明显差异，花苞期、初花期以β-蒎烯含量最高，盛花期以α-蒎烯含量最高，末花期以D-柠檬烯含量最高。倍半萜类在整个花期有4~5种，含量1.89%~9.38%，末花期含量显著高于盛花期，盛花期又显著高于花苞期和初花期，各花期均以β-石竹烯为主要成分，以末花期含量最高(4.74%)。酯类化合物在整个花期有5~6 种，其中柳酸甲酯在花苞期和初花期含量分别为8.63%和9.82%，至盛花期急剧下降至0.87%；水杨酸乙酯含量在花苞期仅0.53%，到初花期上升至5.11%，盛花期又恢复至0.58%。醇类化合物在整个花期有4~5 种，苯乙醇含量随着发育期而减少，花苞期含量为10.04%,至末花期仅含0.90%，桉叶油醇含量随发育期而增加。

表2 嘉宝果不同发育期花果叶的挥发性成分组成和相对含量Table 2 Volatile composition and relative contents of Myrciaria cauliflora flowers, fruits and leaves at different developmental stages

续表(Continued)

2.2 果实的挥发性成分组成

从嘉宝果青果期、红果期、完熟期、过熟期4个发育期的果实中共检测出相对含量在0.05%以上的化合物39 种，各有35、17、14 和17 种，共有成分10 种。由表2, 4 可知，与花相似，果实发育过程中挥发性成分包含萜烯类、酯类、醇类和其他化合物4 大类，整个果实发育期均以萜烯类化合物为主体成分，含8~29 种化合物，含量随果实发育成熟而减少，青果期的含量为94.12%，过熟期为72.47%。酯类化合物种类及含量以完熟期最高，显著高于其他3 个时期，醇类化合物和其他类化合物以过熟期含量最高，显著高于其他3 个时期。

果实整个发育期萜烯类物质以单萜类为优势成分，其含量极显著高于倍半萜，单萜类的主要成分为α-蒎烯、β-蒎烯、D-柠檬烯、β-罗勒烯，与嘉宝果花相似(表2, 4)。但与花挥发性成分特征存在多个不同之处，整个果实发育阶段单萜类含量随果实成熟而下降，且均以D-柠檬烯含量最高，倍半萜类种类数高于单萜类，各果实发育期倍半萜类不只以β-石竹烯为主要成分，果实完熟期倍半萜类以毕澄茄烯为主。表4 显示果实完熟期最显著的特征为: D-柠檬烯含量(15.48%)为整个发育期最低值，约为高峰期时(红果期，29.65%)一半，而(+)-香橙烯、毕澄茄烯、己二烯含量却达到整个发育期的峰值，分别为4.49%、14.05%、4.12%，远高于其他3 个发育期; 酯类化合物4 种，含量达到14.81%，显著高于红果期(1 种，2.42%)、过熟期(2 种，2.26%)、青果期(3 种，0.72%)，4 种成分分别为(Z)-2-丁烯酸乙酯(5.69%)、苯酸甲酯(3.46%)、乙酸芳樟酯(2.85%)、丁酸乙酯(2.80%)。各发育期果实中醇类物质以桉叶油醇为主，含量3.03%~9.32%。

表4 嘉宝果果实的挥发性成分和相对含量Table 4 Volatile composition and relative contents of Myrciaria cauliflora fruits at different development stage

2.3 叶片的挥发性成分组成

从嘉宝果嫩叶、老叶中共检测出相对含量在0.05%以上的化合物共有40 种，嫩叶、老叶均含38种，其中共有成分36 种。由表2, 5 可知，与嘉宝果花果相似，叶片挥发性成分包含萜烯类、酯类、醇类以及其他化合物4 大类，嫩叶、老叶均以萜烯类化合物为主体成分，分别含31、29 种化合物，含量分别为95.86%、69.98%，嫩叶中萜烯类化合物含量显著高于老叶，而酯类(0.26%)、醇类(1.93%)和其他类(0.44%)含量显著低于老叶(4.35%、24.04%、0.73%)。

与嘉宝果花、果相似，叶片中萜烯类物质以单萜类为优势成分，其含量极显著高于倍半萜；单萜类的主要成分为α-蒎烯和β-蒎烯等(表3, 5)。与嘉宝果果实相似，叶片中倍半萜类种类明显高于单萜类。嫩叶中单萜类化合物含量(71.36%)显著高于老叶(49.51%)，其中α-蒎烯、β-蒎烯含量分别为29.53%、32.54%，老叶中分别为25.67%、13.97%，嫩叶、老叶中D-柠檬烯、β-罗勒烯的含量均<5%。嫩叶中倍半萜类含量(24.50%)显著高于老叶(20.47%)，其中β-石竹烯含量最高，为11.51%，其次为β-胡椒烯(3.54%)、(-)-β-花柏烯(2.97%)，老叶中倍半萜类以β-胡椒烯含量最高，为9.19%，其次为β-石竹烯(4.70%)、α-胡椒烯(2.33%)。酯类化合物在嫩叶中只检测到乙酸芳樟酯(0.26%)，而老叶中含乙酸叶醇酯(4.01%)、乙酸己酯(0.05%)、乙酸芳樟酯(0.30%)。嫩叶、老叶中醇类化合物均以桉叶油醇为主，老叶中含量(23.52%)远高于嫩叶(1.68%)。

表3 嘉宝果花果叶的萜烯类组成Table 3 Terpenes in flowers, fruits and leaves of Myrciaria cauliflora

表5 嘉宝果叶片的挥发性成分和相对含量Table 5 Volatile composition and relative contents of Myrciaria cauliflora leaves at different development stage

2.4 T/E 随发育期的变化

T/E 是挥发物中萜烯类化合物和酯类化合物相对含量的比值，其反映了这2 类成分的消长动态和香气感官特征的改变。萜烯类化合物香气淡雅幽香，酯类化合物香气较为浓郁刺激，T/E 的变化在一定程度上反映了香气协调性。嘉宝果在花开放过程中，T/E 呈增加趋势，在果实成熟过程中呈降低趋势，过熟期略有回升。嫩叶的T/E 远高于老叶及花、果(图1)。

图1 嘉宝果花、果、叶不同发育期的T/E 变化。1: 花苞期; 2: 初花期; 3: 盛花期; 4: 末花期; 5: 青果期; 6: 红果期; 7: 完熟期; 8: 过熟期; 9: 嫩叶;10: 老叶。Fig. 1 Changes in T/E value in flowers, fruits and leaves of Myrciaria cauliflora at different developmental stages. 1: Budding stage; 2: Early flower stage;3: Full flower stage; 4: Late flower stage; 5: Green fruit stage; 6: Red fruit stage; 7: Mature stage; 8: Overripe stage; 9: Young leaf; 10: Old leaf.

2.5 花、果、叶不同发育期的香气相似率

从表6 可见，嘉宝果初花期与花苞期的香气相似率为0.985，盛花期与初花期为0.922，末花期与盛花期为0.989，表明嘉宝果花在开花进程中香气类型变化不大。不同发育期果实间的香气相似率为0.759~0.960，青果期和红果期的相似程度最高，为0.960，过熟期和完熟期的最低，为0.759。嫩叶和老叶的香气相似率为0.753。果实与花的相似率为0.680~0.899，叶片与花为0.600~0.820，叶片与果实相似率最低，为0.459~0.669。

表6 花果叶不同发育期香气相似率Table 6 Similarity rate of flavor of Myrciaria cauliflora flowers, fruits and leaves at different developmental stages

3 结论和讨论

药用植物挥发性成分具有绿色天然、健康安全、成分复杂、生物活性多样等特性，已成为当前关注的热点，有巨大的开发潜力，检测分析药用植物挥发性成分对医药农药研发、保健型园林创建、药用植物资源的二次研发等均具有重要的现实意义[11]。

植物花的芳香成分由一系列低分子量、高脂溶性、低沸点、易挥发的化合物所组成[16]，主要是萜烯类和苯丙酸类/苯环型化合物。一般情况下，萜烯类化合物对植物花香的贡献最大，几乎所有植物的花香挥发性成分中都含有萜烯类，主要是单萜类和倍半萜类[17]，最常见的是罗勒烯、α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、石竹烯等[18]。嘉宝果各种花香挥发物含量随着整朵花的开放与衰老而变化明显，整个花期均以萜烯类中的单萜类为优势成分，主要包括α-蒎烯、β-蒎烯、D-柠檬烯、β-罗勒烯等，与大多植物花香较为一致。嘉宝果花苞期和初花期还存在含量较高的苯乙醇和柳酸甲酯，其属于苯丙酸类/苯环型化合物，该类化合物是植物花香成分的第二大类物质[16]，花中广泛存在。月季中苯乙醇含量超过月季总挥发物组分的50%[19]，柳酸甲酯又称水杨酸甲酯，是蜡梅花香的主要香气成分之一，且随花发育期的延长含量降低，至萎蔫期含量最低[13]，本研究嘉宝果柳酸甲酯的变化规律与之相似。

香气是水果及其产品最重要的质量指标之一,其客观反映了果实的风味、成熟度和商品品质[20]。水果中挥发性香气物质主要包括酯类、醇类、醛类、酮类、内酯类、萜烯类及含硫化合物等[21]。果实的挥发性物质组成与水果类别、品种、成熟度、土壤、气候等均息息相关，石榴(Punica granatum)[22]、番石榴(Psidium guajava)[23]挥发性成分中己醛、己烯醛等醛类化合物含量最高，菠萝(Ananas comosus)[24]和香蕉(Musaspp.)[25]中以酯类化合物含量最高，芒果[26]中以萜烯类化合物含量最高，占总香气成分的70.01%~99.04%，其中以单萜类中的3-长松针烯、(+)-4-长松针烯含量最高。本研究中的嘉宝果与芒果[26]较相似，以萜烯类的单萜类为主要成分，但具体成分与芒果不同。嘉宝果果实与花相似，主要成分包括α-蒎烯、β-蒎烯、D-柠檬烯、β-罗勒烯等, 但完熟期果实与其他发育期果实的其他香气成分区别较明显，酯类、(+)-香橙烯、毕澄茄烯含量远高于其他发育期，这可能是赋予嘉宝果成熟果实特殊浓郁香气的重要因素。

大多数桃金娘科植物叶含有挥发性精油，散发出芳香气味，具有多种保健功效[27]。陈佳龄等[27]的研究表明6 种桃金娘科植物叶中的挥发性成分主要为萜烯类，各种的优势成分差异明显，红果仔(Eugenia uniflora)和海南蒲桃(Syzygium hainanense)主要挥发性成分是(Z)-β-罗勒烯、β-石竹烯等，红鳞蒲(S. hancei)为(R)-柠檬烯、α-蒎烯、β-石竹烯等, 黄金香柳(Milleara bracteata)为甲基丁香酚、萜品油烯等，白千层(Melaleuca leucadendron)为α-蒎烯、β-石竹烯等，柠檬桉(Eucalyptus citriodora)为香茅醇、乙酸香茅酯等。嘉宝果也为桃金娘科植物，嫩、老叶也以萜烯类为主要成分，但嫩叶主要香气成分为β-蒎烯、α-蒎烯、β-石竹烯等，老叶主要为α-蒎烯、桉叶油醇、β-蒎烯等，与以上6 种桃金娘科植物均明显不同，与白千层略为接近，与大多数嘉宝果品种叶片也差异较大，与Myrciaria tenella[15]的主要成分类型较一致，这与品种特性、生长环境等密切相关。

蒎烯包括α-和β-蒎烯2 种异构体，具有较好的抑菌、抗炎、抗氧化等作用[28-29]。嘉宝果花、果、叶挥发物共有特征为主要成分中均含有丰富的蒎烯成分，尤其嘉宝果嫩叶蒎烯含量高达62.07%, 精油含量可达0.37%[12]，因此嘉宝果叶片挥发物在抗菌、抗炎、抗氧化等方面有较高的应用价值, 目前已有研究证明嘉宝果叶片提取物对6 种口腔细菌具有抑制作用[30]，在植株各部位中嫩叶的抗氧化活性最强[31]。

综上，嘉宝果花、果、叶挥发性成分以萜烯类为主要成分。萜烯类含量随开花进程呈增加趋势,而随果实和叶片成熟进程呈下降趋势。花、果、叶共有的主要成分为α-蒎烯、β-蒎烯，花、果共有的其他成分有D-柠檬烯、β-罗勒烯等。柳酸甲酯、苯乙醇为花特有主香成分，毕澄茄烯为完熟果特有主香成分，桉叶油醇和β-胡椒烯为老叶特有主香成分。