毛山小橘枝叶中生物碱类成分的研究

吴寿远, 周戚, 陈子明*, 黄国玲

(1. 岭南师范学院化学化工学院，广东 湛江 524000; 2. 台州学院高等研究院，天然药物与健康产品研究所，浙江 台州 318000)

毛山小橘(Glycosmis craibii)是芸香科(Rutaceae)山小橘属植物，常见于云南南部(元江等地)，在泰国东北部也有分布[1]。本属药用植物在民间用于治疗多种疾病，如印度民间G. arborea用作降体温、肝部不适及其他疾病[2]，G. citrifolia用作治疗皮肤瘙痒、疥疮和皮肤溃疡[2]。山小橘(G. pentaphylla)醇提取物展示出显著的杀蚊虫和护肝作用[3], 但是关于毛山小橘植物化学成分研究尚未见文献报道。本课题组一直从事热带药用植物活性成分研究[4],前期从毛山小橘中分离得到一个抗肿瘤活性显著的新颖吲哚生物碱和四个具有抗炎活性的肟类化合物[5-6]。为了进一步从该植物中寻找活性成分, 阐明其药效作用的物质基础，本课题组对毛山小橘枝叶的化学成分进行了系统研究。本文报道从毛山小橘枝叶95%乙醇提取物中分离得到的9 个生物碱类化合物。

1 材料和方法

1.1 仪器和材料

瑞士布鲁克公司生产的Bruker AV-400 MHz 超导核磁共振仪；德国Finnigan 公司生产的Finnigan-MAT-95-MS 质谱仪；日本东京理化公司生产的N-1100D-W 直立式旋转蒸发仪；武汉药科新技术开发有限公司生产的YOKO-ZX 紫外分析暗箱；上海青浦沪西仪器有限公司生产的BSZ-100自动部分收集器；美国安捷伦公司生产Agilent 1260 分析型高效液相色谱仪、Agilent 1260 制备型高效液相色谱仪；美国Amersham Biosciences 公司生产Sephadex LH-20 凝胶；美国Merck 公司生产的ODS 柱色谱材料(C18, 10~40μm); 青岛海洋化工厂生产的柱层析硅胶(200~300 和300~400 目)，所用试剂均为分析纯，购买于西陇化工股份有限公司。

试验材料于2018 年8 月采自中国科学院西双版纳热带植物园，由浙江省丽水市林业科学研究院王军峰副研究员鉴定为芸香科山小橘属植物毛山小橘(Glycosmis craibii)的干燥枝叶，凭证标本(No.W180801)保存于台州学院高等研究院天然药物与健康产品研究所标本室。

1.2 提取和分离

取10.0 kg 毛山小橘新鲜枝叶晾干，粉碎成粗粉, 用95%乙醇浸泡3 次，溶剂体积依次为20.0、15.0 和15.0 L，每次浸泡1 周，合并浸泡液，减压浓缩至无醇味得总浸膏。将总浸膏分散于温水混悬后依次分别用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，减压回收溶剂后得石油醚萃取部位(69.0 g)和乙酸乙酯萃取部位(90.0 g)。将石油醚部位经硅胶柱色谱分离,以石油醚-丙酮为洗脱剂[80∶20→50∶50,V/V]梯度洗脱，收集洗脱流份，每份1 L，减压浓缩至干,TLC 检测合并主点相同的流份，得组分Fr.1~Fr.5。组分Fr.3 (10.3 g)经ODS 柱色谱进行分离，以甲醇-水为洗脱剂[20∶80→100∶0,V/V]进行梯度洗脱,得到8 个亚组分Fr.3A~Fr.3H。Fr.3B 经葡聚糖凝胶柱色谱(氯仿-甲醇, 1∶1)分离，经制备型HPLC 纯化, 以乙腈-水(55∶45)为流动相，流速20 mL/min，制得化合物4 (tR=14.8 min, 2.8 mg)、6 (tR=22.3 min,17.4 mg)、7 (tR=25.6 min, 13.8 mg)和8 (8.8 mg)。Fr.3D 经硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮为洗脱剂[25∶75→50∶50,V/V]进行梯度洗脱，洗脱组分经葡聚糖凝胶柱色谱(石油醚-氯仿-甲醇，40∶20∶20)分离纯化, 经制备HPLC 纯化，以乙腈-水(45∶55)为流动相，流速20 mL/min，制备获得化合物1 (tR=11.2 min, 55.7 mg)和3 (tR=13.2 min, 89.7 mg)。Fr.3F经硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯(20∶80→0∶100,V/V)为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱组分经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱(氯仿-甲醇, 50∶50)纯化, 以甲醇-水(80∶20)为流动相，经制备型HPLC 进行制备得到化合物2 (tR=21.3 min, 19.0 mg)、5 (tR=16.5 min, 32.4 mg)和9 (tR=23.5 min, 4.8 mg)(图1)。

图1 化合物1~9 结构式Fig. 1 Structures of compounds 1-9

1.3 结构鉴定

化合物1 黄色油状物，与改良的碘化铋钾反应显色呈阳性，ESI-MSm/z: 316.1 [M + Na]+, 分子式为C18H15NO3,1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δH14.68 (1H, s, OH-1), 11.16 (1H, s, NH-10), 8.15(1H, dd,J= 8.0, 1.6 Hz, H-8), 7.79 (1H, td,J= 8.0,1.6 Hz, H-6), 7.74 (1H, dd,J= 8.0, 1.6 Hz, H-5), 7.28(1H, td,J= 8.0, 1.6 Hz, H-7), 7.10 (1H, d,J= 10.4 Hz,H-1ʹ), 6.04 (1H, s, H-2), 5.72 (1H, d,J= 10.4 Hz, H-2′),1.43 (3H, s, 4′-CH3), 1.43 (3H, s, 5′-CH3);13C NMR(100 MHz, DMSO-d6):δC180.6 (C-9), 163.8 (C-3),159.2 (C-1), 141.0 (C-10a), 137.9 (C-4a), 133.9 (C-6),125.6 (C-8), 124.9 (C-2′), 121.8 (C-7), 118.9 (C-8a),117.6 (C-1′), 116.1 (C-5), 104.0 (C-4), 98.1 (C-9a),96.2 (C-2), 77.1 (C-3′), 27.5 (4′-CH3), 27.5 (5′-CH3)。以上波谱数据与文献[7]报道的一致，故鉴定为de-N-methyl-O-noracronycine。

化合物2黄色不定形粉末，与改良的碘化铋钾反应显色呈阳性，ESI-MSm/z: 330.1 [M + Na]+,分子式为C19H17NO3,1H NMR (400 MHz, CDCl3):δH14.70 (1H, s, OH-1), 8.37 (1H, dd,J= 8.0, 1.6 Hz,H-8), 7.71 (1H, td,J= 8.0, 1.6 Hz, H-6), 7.43 (1H, dd,J= 8.0, 1.6 Hz, H-5), 7.30 (1H, td,J= 8.0, 1.6 Hz,H-7), 7.55 (1H, d,J= 10.4 Hz, H-1′), 6.26 (1H, s,H-2), 5.50 (1H, d,J= 10.4 Hz, H-2′), 4.90 (3H, s, NCH3), 1.53 (3H, s, 4′-CH3), 1.53 (3H, s, 5′-CH3);13C NMR (100 MHz, CDCl3):δC181.3 (C-9), 165.4 (C-3),161.7 (C-1), 145.1 (C-10a), 144.6 (C-4a), 134.1 (C-6),126.4 (C-8), 123.1 (C-2′), 122.2 (C-7), 122.1 (C-8a),121.7 (C-1′), 116.3 (C-5), 107.1 (C-4), 101.1 (C-9a),98.0 (C-2), 76.5 (C-3′), 43.8 (N-CH3), 27.0 (4′-CH3),27.0 (5′-CH3)。以上波谱数据与文献[8]报道的一致，故鉴定为noracronycine。

化合物3黄色不定形粉末，与改良的碘化铋钾反应显色呈阳性，ESI-MSm/z: 332.1 [M + Na]+,分子式为C19H19NO3,1H NMR (400 MHz, CDCl3):δH14.59 (1H, s, OH-1), 8.34 (1H, dd,J= 8.0, 1.6 Hz,H-8), 7.69 (1H, td,J= 8.0, 1.6 Hz, H-6), 7.39 (1H, dd,J= 8.0, 1.6 Hz, H-5), 7.26 (1H, td,J= 8.0, 1.6 Hz,H-7), 6.38 (1H, s, H-2), 5.41 (1H, t,J= 6.4 Hz, H-2′),3.47 (2H, d,J= 6.4 Hz, H-1'), 3.83 (3H, s, N-CH3),1.81 (3H, s, 4′-CH3), 1.68 (3H, s, 5′-CH3);13C NMR(100 MHz, CDCl3):δC181.7 (C-9), 163.9 (C-3), 163.5(C-1), 147.7 (C-4a), 146.6 (C-10a), 134.7 (C-6), 130.7(C-3′), 126.2 (C-8), 123.5 (C-2′), 121.8 (C-7), 121.7(C-8a), 116.5 (C-5), 107.5 (C-4), 104.7 (C-9a), 97.9(C-2), 44.3 (N-CH3), 27.3 (C-1′), 25.9 (4′-CH3), 18.3(5′-CH3)。经与文献[7]比较，鉴定化合物 3 为glycocitrine II。

化合物4黄色不定形粉末，与改良的碘化铋钾反应显色呈阳性，ESI-MSm/z: 362.1 [M + Na]+,分子式为C19H17NO5,1H NMR (400 MHz, DMSOd6):δH14.65 (1H, s, OH-1), 9.60 (1H, s, NH), 7.78 (1H,d,J= 8.8 Hz, H-8), 6.91 (1H, d,J= 8.8 Hz, H-7), 7.03(1H, d,J= 10.4 Hz, H-1ʹ), 6.03 (1H, s, H-2), 5.69 (1H, d,J= 10.4 Hz, H-2′), 3.93 (3H, s, 5-OCH3), 1.43 (3H, s,4′-CH3), 1.43 (3H, s, 5′-CH3);13C NMR (100 MHz,DMSO-d6):δC180.1 (C-9), 163.8 (C-1), 159.0 (C-3),153.9 (C-6), 137.1 (C-4a), 135.9 (C-10a), 133.1 (C-5),125.5 (C-2′), 121.0 (C-8), 116.2 (C-2′), 113.3 (C-7),113.0 (C-8), 103.3 (C-9a), 98.4 (C-4), 96.4 (C-2), 77.1(C-3′), 60.4 (5-OCH3), 27.5 (4′-CH3), 27.5 (5′-CH3)。以上波谱数据与文献[9]报道的一致，故鉴定为acrifoline。

化合物5 黄色不定形粉末，与改良的碘化铋钾反应显色呈阳性，ESI-MSm/z: 308.1 [M + Na]+,分子式为C16H15NO4,1H NMR (400 MHz, DMSOd6):δH8.28 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-8), 7.83 (1H, m,overlap, H-6), 7.83 (1H, m, overlap, H-6, H-5), 7.34(1H, t,J= 8.0 Hz, H-7), 6.62 (1H, s, H-1), 4.00 (3H, s,2-OCH3), 3.90 (3H, s, N-CH3), 3.73 (3H, s, 4-OCH3);13C NMR (100 MHz, CDCl3):δC179.7 (C-9), 159.3(C-2), 154.9 (C-3), 141.8 (C-10a), 140.2 (C-4a), 134.3(C-5), 129.4 (C-4), 125.4 (C-8), 121.5 (C-7), 119.6(C-8a), 116.1 (C-6), 88.2 (C-1), 59.9 (4-OCH3), 56.1(2-OCH3), 34.2 (N-CH3)。以上波谱数据与文献[10]报道的一致，故鉴定为3-hydroxy-2,4-dimethoxy-10-methyl-9-acridanone。

化合物6 无色晶体粉末，与改良的碘化铋钾反应显色呈阳性，ESI-MSm/z: 266.1 [M + Na]+,分子式为C15H17NO2,1H NMR (400 MHz, DMSOd6):δH7.68 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-5), 7.47 (1H,td,J= 8.0, 2.0 Hz, H-7), 7.32 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz,H-8), 7.19 (1H, td,J= 8.0, 2.0 Hz, H-6), 5.16 (1H, td,J= 6.8, 3.2 Hz, H-2′), 3.86 (3H, s, 4-OCH3), 3.22 (2H,d,J= 6.8 Hz, H-1′), 1.73 (3H, s, 5′-CH3), 1.63 (3H, s,4′-CH3);13C NMR (100 MHz, DMSO-d6):δC163.3(C-2), 160.6 (C-4), 137.7 (C-8a), 131.3 (C-3′), 130.0(C-7), 122.5 (C-5), 122.0 (C-3), 121.8 (C-6), 121.7(C-2′), 116.0 (C-4a), 115.2 (C-8), 61.5 (4-OCH3), 25.5(C-1′), 23.0 (5′-CH3), 17.8 (4′-CH3)。以上波谱数据与文献[11]报道的一致，故鉴定为阿塔宁。

化合物7无色晶体粉末，与改良的碘化铋钾反应显色呈阳性，ESI-MSm/z: 296.1 [M + Na]+, 分子式为C16H19NO3。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δH7.23 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-5), 7.08 (1H, td,J=8.0, 2.0 Hz, H-6), 7.04 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-7),5.15 (1H, td,J= 6.8, 3.2 Hz, H-2′), 3.86 (3H, s, 4-OCH3), 3.81 (3H, s, N-CH3), 3.24 (2H, d,J= 6.8 Hz,H-1′), 1.73 (3H, s, 5′-CH3), 1.63 (3H, s, 4′-CH3);13C NMR (100 MHz, DMSO-d6):δC163.5 (C-2), 159.6(C-4), 146.1 (C-8), 131.3 (C-3′), 128.5 (C-8a), 122.7(C-3), 121.8 (C-6), 121.2 (C-2′), 119.5 (C-4a), 117.3(C-5), 113.8 (C-7), 61.5 (4-OCH3), 34.7 (N-CH3), 25.5(C-1′), 23.8 (5′-CH3), 17.8 (4′-CH3)。以上波谱数据与文献[12]报道的一致，故鉴定为glycosolone。

化合物8黄色油状物，与改良的碘化铋钾反应显色呈阳性，ESI-MSm/z: 310.1 [M + Na]+, 分子式为C17H21NO3,1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δH7.44 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-5), 7.16 (1H, td,J=8.0, 2.0 Hz, H-6), 7.04 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-7),5.25 (1H, td,J= 6.8, 3.2 Hz, H-2′), 3.96 (3H, s, NCH3), 3.89 (3H, s, 8-OCH3), 3.88 (3H, s, 4-OCH3),3.40 (2H, d,J= 6.8 Hz, H-1′), 1.80 (3H, s, 5′-CH3),1.60 (3H, s, 4′-CH3);13C NMR (100 MHz, DMSO-d6):δC165.2 (C-2), 160.2 (C-4), 148.9 (C-8), 132.6 (C-3′),130.7 (C-8a), 122.8 (C-3), 122.6 (C-6), 121.6 (C-2′),120.4 (C-4a), 116.1 (C-5), 113.6 (C-7), 61.8 (8-OCH3),56.8 (4-OCH3), 35.7 (N-CH3), 24.5 (C-1′), 25.8 (5′-CH3), 18.1 (4′-CH3)。以上波谱数据与文献[13]报道的一致，故鉴定为3-(3ʹ,3ʹ-dimethylallyl)-4,8-dimethoxy-N-methyl-quinolin-2-one。

化合物9无色晶体粉末，与改良的碘化铋钾反应显色呈阳性，ESI-MSm/z: 212.1 [M + Na]+, 分子式为C11H11NO2。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δH7.88 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-5), 7.65 (1H, td,J=8.0, 2.0 Hz, H-7), 7.51 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-8),7.26 (1H, td,J= 8.0, 2.0 Hz, H-6), 6.04 (1H, s, H-3),3.95 (3H, s, 4-OCH3), 3.56 (3H, s, N-CH3);13C NMR(100 MHz, DMSO-d6):δC162.3 (C-2), 161.8 (C-4),139.4 (C-8a), 131.4 (C-7), 122.6 (C-5), 121.5 (C-6),115.5 (C-4a), 114.7 (C-8), 96.3 (C-3), 56.1 (4-OCH3),28.6 (N-CH3)。以上波谱数据与文献[14]报道的一致，故鉴定为4-methoxy-N-methyl-2-quinolone。

2 结果和讨论

本研究从毛山小橘枝叶的95%工业乙醇提取物分离鉴定了9 个生物碱类化合物，包括5 个吖啶酮类生物碱和4 个喹诺酮类生物碱，其中化合物2、3、5、6 和9 均为从山小橘属植物中首次发现。据报道，化合物1、2、3 和4 具有抗血小板聚集活性，带有吡喃环的acridone 母核是其活性的主要因素[15];此外，这些吖啶酮化合物可作为HL-60 细胞分化的诱导剂，预示它们具有潜在的癌症预防作用[16]。在过敏反应评价中，化合物5 对肥大细胞脱粒显示出较强的抑制作用[10]。本研究结果在一定程度上阐明了毛山小橘的生物碱类，可为山小橘属植物资源的开发利用提供科学依据。