氧化石墨烯改性丙烯酸酯类软衬材料的抗真菌活性体外分析

伍韩雪，储顺礼，苏屹坤，朱炳震，卢倩倩，王景云

（吉林大学口腔医学院VIP综合科，长春 130021）

国内外关于氧化石墨烯（graphene oxide，GO）生物性的研究众多，其中不乏抗菌活性的探讨[1-3]，这些研究成果或将为GO成为新一代纳米抗菌剂提供更多有力的理论支撑[4]。目前，有报道[5]氧化石墨烯作为抗菌剂加入到义齿基托树脂中，但将GO加入到丙烯酸软衬材料中作为抗菌剂的相关研究较少。本研究将不同质量分数的GO添加到丙烯酸酯类自凝软衬材料中，并以白色念珠菌为菌种，探讨添加不同质量分数GO软衬材料的体外抗菌作用，为临床丙烯酸酯软衬材料抗菌活性的选择提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

自凝软衬垫材料（天驰生物科技有限公司）；单层氧化石墨烯（单层片0.2～10 um，厚度1 nm，纯度99.9%）（深圳市宏达昌进化科技有限公司）；白色念珠菌（Candidaalbicans，ATCC10231，上海鲁微科技有限公司）；沙氏葡萄糖液体（肉汤）培养基（SDB）（杭州微生物）；沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）（杭州微生物）；场发射扫描电子显微镜；晶屏系列超声波处理器 fs-100t（上海生析超声仪器有限公司）；kq-100da 型数控超声波清洗器（云南省昆山市超声仪器有限公司）；冷热循环仪（MX15R，PolyScience，美国威尔公司）；真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；分析天平（METTLER TOLEDO 公司）；L929细胞（CTCC），DMEM培养基 （Hyclone），FBS（Hyclone），青链双抗（上海生工），细胞培养箱（Thermo），荧光倒置显微镜（OLYMPUS，IX71），超净工作台（苏州安泰科技有限公司），离心机（德国Eppendorf公司），CCK-8 （碧云天）， 酶标检测仪（Thermo MK3型），傅里叶变换红外光谱仪（美国赛默飞Nicolet iS5）。

1.2 含不同质量分数氧化石墨烯软衬材料的制备

取适量的GO，按GO/软衬材料的质量比（0.00 wt %，0.25 wt %，0.50 wt %，1.00 wt %，2.00 wt %）添加到去离子水中，用电动搅拌棒搅拌10 min，得到分布均匀的悬浮液体系；然后使用功率为150 W，频率为20 kHz的超声波分散仪继续分散30 min后过滤。将得到的滤渣放到温度为60 ℃，真空度为0.08 MPa的真空干燥箱中干燥24 h，得到分散性较好的填料粉末，然后将不同质量分数的GO加入软衬C液中超声分散20 min，使GO在液体中分散均匀；将粉（g）:液（mL）＝2:1均匀混合，加入到预先定制好的模具中制备出规格10 mm×10 mm×2 mm（±0.2 mm）的样品每组9个，共45个。为排出所有因素的影响，材料准备初期，需将所有样品经蒸馏水洗去附着物，再经超声振荡清洗20 min，最后经紫外线正反面分别照射30 min进行灭菌。

1.3 实验样品表征检测

采用扫描电镜（SEM）对实验样品进行表征检测，具体取样方式为每组随机取出1个样品进行喷金标记。并通过傅里叶变换红外光谱仪对样品材料的官能团进行检测。

1.4 细胞毒性检测

1.4.1 样品浸提液的制备 各组样品浸泡于75%酒精并同时紫外线照射1 h进行消毒，根据GB/T16886.5-2017标准，按培养基体积与试件表面积1 mL:1.25 cm2的比例制成所需液体，每一组分别取3个样品，移入24 mL含有10% FBS的DMEM培养液中37 ℃条件下进行培养，并经过5% CO2培养箱中浸提24 h，最后经过细菌滤器过滤，最终获得不同组别样品的浸提液。分为空白对照组（单纯细胞培养基，无细胞）；阴性对照组（细胞培养基接种细胞）；分别添加0.25 wt %、0.50 wt%、1.00 wt%、2.00 wt% GO的软衬材料样品浸提液为实验组。

1.4.2 细胞株接种与细胞株培养 取冻存的L929细胞，37 ℃快速解冻后，1 200 r·min-1离心5 min，用DMEM培养基清洗 1～2次（因为在冷冻的过程中加入了对细胞繁殖生长有害的物质），用DMEM基础培养基重悬后再离心，加入完全培养基进行培养，每天换一次培养基，观察细胞生长状况，长满后备用。待细胞长满后调整细胞浓度为5×104cells·mL-1，分别接种于96孔培养板中，96孔板每孔200 μL，在37℃，5% CO2于培养箱内培养24 h、48 h、72 h后备用，待各组细胞培养至相应时间点后，进行CCK8检测。

1.4.3 CCK-8检测 换培养液后分别于24 h、48 h、72 h末各取1个培养板，吸弃原培养基，PBS洗涤2次后，按照CCK-8试剂盒操作说明，向每孔中加入20 uL CCK-8，37℃，5% CO2培养箱内培养避光孵育3 h。酶标仪450 nm波长测出同一时间点OD 值，用测得的OD值进行细胞生长影响的分析。以上实验重复3次。

1.4.4 细胞死活染色 将材料浸提液与细胞共培养至72 h后进行死活染色，取出钙黄绿素-AM（Calcein AM solution）和碘化丙啶（PI solution），室温平衡30 min，在10 mL的PBS中加入5 μL的PI solution和5 μL的Calcein AM solution，涡旋振荡混匀制成工作液，此时Calcein AM solution的浓度为2 μm，PI的浓度为8 μm，按照实验要求处理细胞后，用PBS温和洗涤细胞3次，加入足量的染色工作液，保证没过材料，37℃孵育30 min，荧光倒置显微镜拍照观察。

1.5 抗菌性能检测

1.5.1 实验菌液制备 在无菌环境下，将冻干的白色念珠菌冻干菌加入到沙氏培养液中，轻吹几次，使白色念珠菌均匀的分散在培养液中。取2 mL菌悬液接种于沙氏培养液中，于37℃下培养24 h后用移取100 μL培养菌悬液接种在沙氏培琼脂培养基上，上述条件下继续培养24 h。麦氏比浊法将传代的白色念珠菌制备成浓度为1×107CUF·mL-1的菌悬液，备用。

1.5.2 抗菌率检测 采用贴膜法对含不同质量分数GO的软衬材料抗菌性能进行测试。从每组浓度中取3个样品，分别置于15个灭菌板中，然后均加入200 μL白色念珠菌实验菌悬液，用聚丙烯薄膜覆盖，使菌液与样品均匀接触。于37℃培养箱24 h，取出后将20 mL无菌生理盐水加入每组实验样品中，在超声振荡器上剧烈振荡1 min，将器皿中的样品和聚丙烯薄膜清洗彻底，使得洗脱液混合均匀， 然后将其等比例10倍稀释至1×10-2CUF·mL-1。每浓度取100 μL接种于SDA培养基上，在恒温培养箱培养24～48 h，测量细菌的数量，实验重复3次，取平均值。

注：R为抗菌率（%）；A为对照样品回收的平均菌数（CFU /片）；B为抗菌样品回收的平均菌数（CFU /片）；抗菌率r≥99%的抗菌树脂为有较强的抗菌效果

1.6 抗菌持久性的检测

1.6.1 样品的制备与分组 根据抗菌性能的检测结果发现，当软村材料中GO含量为2.00 wt%时，其抗菌率最高，可达99%，因此选择GO添加量为2.00 wt%的软衬材料，样品的制备方法与材料和方法1.2相同。

1.6.2 菌液的配置 菌液的配置方法同1.5.1。

1.6.3 软衬材料体外老化处理 分为5组，每组6个。1）空白对照一组：未添加GO的软衬材料经过紫外线灯照射8 h；2）空白对照二组：在5～55 ℃的条件下冷热循环5 000次老化处理；3）新制备组：未经任何处理的抗菌试件；4）实验一组：紫外线灯照射8 h；5）实验二组：5～55 ℃的条件下冷热循环5 000次。

1.6.4 抗菌率测定 抗菌率检测同1.5.2。

1.7 统计学方法

采用SPSS 24.0软件进行统计分析，数据采用正态分布和方差齐性检验两种方法进行分析。

2 结果

2.1 样品表征

2.1.1 样品表面形貌 用SEM观察不同组样品的表面形貌，见图1。

图1 添加不同质量分数GO的软衬材料表面形貌观察（×5000）

2.1.2 傅里叶变换红外光谱分析 由红外光谱分析可知，5个样品在软衬材料和GO官能团如- CH2（2 958 cm-1）、C= O（1 719 cm-1）、C-H（1 449 cm-1）、C-O-C（1 179cm-1）和 C-O（1 072 cm-1）处均有特征峰，各组波形未见明显差异（P＞ 0.05）（见图2）。

图2 氧化石墨烯改性丙烯酸酯类软衬材料5个样品的红外光谱对比图

2.2 体外细胞毒性

2.2.1 CCK-8检测结果 含有不同质量分数GO的义齿软衬材料体外细胞毒性（见图3），在相同的时间处理里，5种材料浸提液对于细胞增殖均无抑制效果。

图3 不同时间点稀释物质提取物对细胞增殖的影响

2.2.2 活死细胞染色结果 通过荧光显微镜观察，各组的L929细胞存活率均在98%以上（见图4），各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

图4 软衬材料的体外细胞毒性

2.3 样品的抗菌性检测

2.3.1 菌落数计量和抗菌率检测 通过对比各组样品白色念珠菌的抗菌效果涂片，可以明显的发现对照组中菌落最多且密集，而各实验组菌落相对较少且稀疏（见图5）。统计结果表明，各实验组白色念珠菌的菌落数均呈现显著降低（P＜0.01）。1.00 wt%组对白色念珠菌的抗菌率为93.04%，具有抗菌作用；2.00 wt%组对白色念珠菌的抗菌率为99.41%，具有强抗菌作用（见表1）。

图5 各组样品对口腔白色念珠菌的抗菌效果

表1 各组样品对白色念珠菌的抗菌率（±s）

表1 各组样品对白色念珠菌的抗菌率（±s）

注：与对照组比较，## P＜0.01

组别 GO添加量/wt% 菌落数/105 CFU·mL-1 抗菌率/%对照组 0.00 460.001.65 —实验一组 0.25 136.004.32 70.43##实验二组 0.50 65.004.32 85.87##实验三组 1.00 32.005.89 93.04##实验四组 2.00 2.671.70 99.41##

2.3.2 老化后菌落数计量和抗菌率检测 见表2。

表2 加入2wt%GO的义齿软衬材料经老化处理后对白色念珠菌作用（±s，n= 6）

表2 加入2wt%GO的义齿软衬材料经老化处理后对白色念珠菌作用（±s，n= 6）

注：与新制备组比较，# P＜0.05

组别 菌落数/105 CFU·mL-1 抗菌率/%空白一组 46.002.65 -空白二组 43.001.29 -新制备组 3.001.63 93.48实验一组 11.001.83 76.09#实验二组 6.001.29 86.96#

3 讨论

石墨烯由于其独特的物理化学性质，在超级电容器、锂离子电池、太阳能电池、电化学传感器、气体传感器、透明导电电极、场发射装置、电子器件、光催化、能源相关领域和聚合物基纳米复合材料等各个研究领域得到了广泛的研究[6]。GO具有各种反应官能团，环氧和酚羟基位于其基面上，羧基位于其边缘[7]。因此，GO纳米片在水中具有良好的化学稳定性和分散能力[8]，从而更易于与聚合物制备成复合材料。初步研究发现，石墨烯基纳米材料对革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌[9]甚至包括真菌病原体[10]均能产生毒性作用，抑制其生长。GO具有边缘切割效应，细胞包埋能力和氧化应激反应等多重抗菌机制，其抗菌能力相较于石墨烯得到了有效提升[11]，因此其被认为是目前最有效的新兴纳米抗菌材料[4]。

图6 各组样品对口腔白色念珠菌的长期抗菌效果

本实验采用贴膜法将实验菌液直接涂抹在软衬材料表面，模拟临床中菌斑在软衬材料表面的沉积的过程。抑菌实验结果显示，各实验组对白色念珠菌均抑菌作用，且随软衬材料中GO含量的增加，抑菌效果增强。Lee等[12]研究发现，树脂基质添加GO可对白色念珠菌的生长和粘附起到明显的抑制作用。本实验中，1 wt%组可称为“有抗菌作用”，2 wt%组可称为“有强抗菌作用”，实验还采用加速老化处理的方法研究了其抗菌效果的持久性。结果表明，经过加速老化处理后，2 wt%GO组相较于未经处理的组的抗菌性能略有下降，但仍有较好的抗菌效果。

实验结果表明，当丙烯酸酯义齿软衬材料中GO含量为2 wt%时，对白色念珠菌抗菌效果最好，这对抗菌义齿进一步的研究和开发提供了重要的理论依据。相信随着技术的进步和理论的不断完善，GO义齿软衬材料终将有望应用于临床，成为一种新型抗菌义齿软衬材料。本实验中，随着GO含量的增加，软衬材料的颜色逐渐加深，固化时间延长，黏性变大。本实验的不足之处，只探讨了GO对浮游态白色念珠菌的抗菌效果，未对生物膜状态下的抗菌率进行探讨。今后的研究方向将在GO义齿软衬材料颜色的改善、抗菌机理和生物安全性方面展开，为GO义齿软衬材料早日应用于临床做好充分的准备。