栀子苷通过Nrf2/Keap1/ARE通路减轻重症胰腺炎大鼠的肝损伤

王 丹，刘 捷，张细元，刘 萍，彭罕鸣

（华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院/武汉市妇幼保健院消化内科，武汉 430015）

研究[1]显示，黄褐毛忍冬提取物中包括栀子苷在内的24种可能被吸收的化学成分可作用于319个急性肝损伤靶点，可能具有保肝的作用。核因子E2相关因 子 2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Kelch-like epichlorohydrinrelated protein-1，Keap1）/抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）通路在维持氧化还原平衡方面发挥重要作用，是氧化应激相关疾病防治的重要靶点[2]。本研究将探讨栀子苷对SAP大鼠肝损伤的影响，并初步探讨Nrf2/Keap1/ARE通路在其中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD雄性大鼠，6～7周龄，体质量200～260 g，购自杭州子源实验动物科技有限公司，动物许可证编号：SCXK（浙）2019-0004。饲养环境：12 h光照/12 h黑暗，温度20～25℃，湿度50%～60%，自由进水进食。适应性喂养1周。

1.1.2 主要试剂 栀子苷（货号：D1773，HPLC≥98%）购自上海宝曼生物科技有限公司；牛磺胆酸钠（货号：B20918-20 mg，HPLC≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司；苏木精-伊红（hematoxylineosin，HE）染色试剂盒（货号：RS3390-3）购自金克隆（北京）生物技术有限公司；大鼠超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonydialdehyed，MDA）、内毒素、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）酶联免疫（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（货号：SBJ-R0008、SBJ-R0007、SBJ-R0392、SBJ R0546、SBJ-R0040）购自南京森贝伽生物科技有限公司；丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）ELISA试剂盒（货号：GD-E005277866、GD-E0182-76993）购自上海冠导生物工程有限公司；兔抗Nrf2、兔抗Keap1、兔抗血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）、兔抗GAPDH、山羊抗兔二抗（货号：ab62352、ab627828、ab189491、ab128915、ab6721）购自美国abcam。

1.1.3 主要仪器 BX43型显微镜购自日本Olympus公司；Stat-Fax 2100型酶标仪购自美国Awareness公司；GelDocEZ型凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组、造模及给药 用随机数字表法将大鼠随机分为5组：假手术组、SAP组和栀子苷低、中、高剂量组，每组10只大鼠。大鼠术前均禁食12 h，自由饮水，腹腔注射10%水合氯醛（300 mg·kg-1）麻醉。将大鼠平卧捆绑于鼠板台，腹部备皮、剖腹，向胆胰管内以0.2 mL·min-1匀速逆行注入5%牛磺胆酸钠（1.5 mL·kg-1）制备SAP模型[3]，缝合腹部切口。假手术组大鼠开腹后轻微翻动胰腺组织数次，并向胆胰管内注入等量的生理盐水后关腹。所有大鼠手术清醒后自由取水，单笼饲养。造模后2 h，栀子苷低、中、高剂量组大鼠分别给予12.5 mg·kg-1、25.0 mg·kg-1、50.0 mg·kg-1栀子苷灌胃[4]，假手术组、SAP组大鼠均灌胃等量的生理盐水。

1.2.2 标本采集 术后24 h，大鼠腹主动脉取血2～5 mL，3 000 r·min-1离心10 min，分离血清保存于-20℃冰箱，用于肝功能指标、内毒素、氧化应激指标、炎症指标检测。将大鼠断头处死，解剖留取肝组织，用于HE染色及蛋白检测。

1.2.3 肝组织HE染色 取左侧肝组织，用4%中性福尔马林固定，脱水、包埋后切成厚度为2 μm的切片，参照HE染色试剂盒说明书步骤进行HE染色，用光学显微镜观察肝组织病理变化。

1.2.4 氧化应激指标、内毒素、肝功能指标、炎症指标检测 使用SOD、MDA、内毒素、ALT、AST、IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒测定血清SOD、MDA、内毒素、ALT、AST、IL-1β、TNF-α水平，具体步骤按说明书进行操作，酶标仪测定吸光度（optical density，OD）值，根据标准曲线计算得出血清SOD、MDA、内毒素、ALT、AST、IL-1β、TNF-α水平。

1.2.5 肝组织中Nrf2/Keap1/ARE通路相关蛋白检测 取右侧肝组织，用手术剪剪成小块，用匀浆器充分研磨，加入预冷的RIPA裂解液冰浴提取总蛋白，BCA法测定提取总蛋白浓度。将蛋白样品95℃水浴5 min使蛋白变性，取等量蛋白加入上样缓冲液混匀，随后在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，将电泳分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶封粉闭1.5 h，加入一抗兔抗Nrf2（1:1 000）、兔抗Keap1（1:1 000）、兔抗HO-1（1:500）、兔抗GAPDH（1:2 000），4℃孵育过夜，用TBST洗涤3次，加入的山羊抗兔二抗（辣根过氧化物酶标记，1:2 000），室温孵育1 h，用TBST清洗3次，加入显色剂显色，凝胶成像系统成像，Image J软件分析蛋白条带灰度值，根据内参GAPDH条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

数据用SPSS 24.0软件进行分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较进行单因素方差分析，两两比较进行SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织病理变化

HE染色显示，假手术组肝组织未见明显病理损伤；SAP组肝组织中肝细胞体积肿大、形态不规则，空泡化严重，存在炎性细胞浸润及肝坏死灶；与SAP组相比，栀子苷低、中、高剂量组肝组织病理损伤情况有不同程度地减轻（见图1）。

图1 HE染色观察各组肝组织病理变化（×200）

2.2 各组血清SOD、MDA水平比较

见表1。

表1 各组大鼠血清SOD、MDA水平比较（±s，n=10） nmol·mL-1

表1 各组大鼠血清SOD、MDA水平比较（±s，n=10） nmol·mL-1

注：与假手术组比较，# P＜0.05；与SAP组比较，△P＜0.05；与栀子苷低剂量组比较，▲P＜0.05；与栀子苷中剂量组比较，□P＜0.05

组别 SOD MDA假手术组 4.28±0.46 1.12±0.14 SAP 组 0.97±0.10# 3.35±0.36#栀子苷低剂量组 2.04±0.19#△ 2.84±0.23#△栀子苷中剂量组 2.59±0.24#△▲ 2.45±0.21#△▲栀子苷高剂量组 3.14±0.25#△▲□ 2.02±0.20#△▲□

2.3 各组血清内毒素水平比较

见表2。

表2 各组血清内毒素水平比较（±s，n=10）EU·mL-1

表2 各组血清内毒素水平比较（±s，n=10）EU·mL-1

注：与假手术组比较，# P＜0.05；与SAP组比较，△P＜0.05；与栀子苷低剂量组比较，▲P＜0.05；与栀子苷中剂量组比较，□P＜0.05

组别 内毒素假手术组 0.08±0.02 SAP组 0.33±0.05#栀子苷低剂量组 0.26±0.04#△栀子苷中剂量组 0.21±0.04#△▲栀子苷高剂量组 0.14±0.03#△▲□

2.4 各组血清ALT、AST水平比较

见表3。

表3 各组血清ALT、AST水平比较（±s，n=10） U·L-1

表3 各组血清ALT、AST水平比较（±s，n=10） U·L-1

组别 ALT AST假手术组 42.45±6.36 107.90±10.05 SAP组 385.38±40.74# 523.42±52.17#栀子苷低剂量组 265.42±32.25#△ 378.29±36.72#△栀子苷中剂量组 221.06±27.84#△▲ 314.26±33.25#△▲栀子苷高剂量组 176.47±25.03#△▲□ 259.68±30.68#△▲□

2.5 各组血清IL-1β、TNF-α 水平比较

见表4。

表4 各组血清IL-1β、TNF-α 水平比较（±s，n=10） ng·L-1

表4 各组血清IL-1β、TNF-α 水平比较（±s，n=10） ng·L-1

注：与假手术组比较，# P＜0.05；与SAP组比较，△P＜0.05；与栀子苷低剂量组比较，▲P＜0.05；与栀子苷中剂量组比较，□P＜0.05

组别 IL-1β TNF-α假手术组 30.32±3.53 38.45±4.62 SAP 组 285.37±20.46# 312.41±25.84#栀子苷低剂量组 226.01±16.48#△ 258.78±22.73#△栀子苷中剂量组 188.85±15.72#△▲ 216.64±20.16#△▲栀子苷高剂量组 143.23±15.24#△▲□ 177.80±20.53#△▲□

2.6 各组肝组织中Nrf2/Keap1/ARE通路相关蛋白表达水平比较

见图2、表5。

图2 各组肝组织中Nrf2/Keap1/ARE通路相关蛋白表达情况

表5 各组肝组织中Nrf2/Keap1/ARE通路相关蛋白表达水平比较（±s，n=10） GAPDH

表5 各组肝组织中Nrf2/Keap1/ARE通路相关蛋白表达水平比较（±s，n=10） GAPDH

注：与假手术组比较，# P＜0.05；与SAP组比较，△P＜0.05；与栀子苷低剂量组比较，▲P＜0.05；与栀子苷中剂量组比较，□P＜0.05

组别 Nrf2 Keap1 HO-1假手术组 0.63±0.05 0.65±0.06 0.88±0.07 SAP 组 0.30±0.04# 0.34±0.03# 0.41±0.04#栀子苷低剂量组 0.38±0.04#△ 0.41±0.04#△ 0.50±0.05#△栀子苷中剂量组 0.45±0.05#△▲ 0.49±0.05#△▲ 0.62±0.05#△▲栀子苷高剂量组 0.54±0.05#△▲□ 0.55±0.06#△▲□ 0.74±0.06#△▲□

3 讨论

肝脏是各种因子的主要靶器官及灭活场所，作为胰腺血液回流的第一站，在SAP发生后最容易受损[5]。研究显示，SAP的特点是产生并释放大量炎症介质及活性氧等细胞因子，可激活肝巨噬细胞引起炎症反应综合征，导致肝损伤，降低肝功能，并进一步刺激肝脏释放更多的炎症介质进入体循环，对全身其他脏器产生损伤[6]。本研究通过逆行胆胰管注射牛黄胆酸钠制备SAP模型，结果显示，SAP组大鼠肝组织中肝细胞体积、形态出现明显变化，有炎性细胞浸润、肝细胞坏死现象出现，同时血清ALT、AST水平显著升高，提示SAP大鼠已出现肝损伤，且肝功能明显下降。此外，SAP组大鼠血清SOD水平显著降低，MDA、内毒素、IL-1β、TNF-α水平显著升高，提示SAP大鼠体内氧化应激及抗氧化应激反应失衡，存在一定炎症反应，同时肝组织功能的下降导致内毒素未被有效清除，已有大量内毒素进入体循环。

炎症反应、氧化应激反应是加重SAP并发脏器损伤的主要因素，以炎症反应、氧化应激反应为治疗靶点展开治疗已成为减轻SAP并发脏器损伤的重要方向。Li等[7]研究显示，使用AG490抑制JAK2通路可减轻SAP相关的肝损伤，该机制可能与抑制TNF-α、IL-6和IL-18等促炎因子活性有关。Zhang等[8]研究显示，在SAP早期诱导HO-1可能通过抑制TNF-α、促进IL-10来调节全身炎症反应，并预防胰腺及肝损伤。Xu等[9]研究表明，大剂量的维生素C可通过Nrf2/NQO1/HO-1途径抑制氧化应激，从而减轻SAP的胰腺损伤。栀子苷主要提取自茜草科植物栀子的果实，现代医学证实栀子苷具有抗氧化、抗炎等药理作用。邓怒骄等[10]研究发现，栀子苷可以减轻炎症反应，从而减轻酵母多糖引起的大鼠肠黏膜屏障损伤。马金安等[11]研究显示，栀子苷可以通过激活PI3K/Akt通路，抑制心肌缺血再灌注后的氧化应激反应及细胞凋亡，从而发挥保护作用。本研究显示，低、中、高剂量的栀子苷均能减轻SAP大鼠的肝组织病理损伤，降低大鼠血清ALT、AST、内毒素水平，并呈剂量依赖性，提示栀子苷可减轻SAP大鼠肝损伤，提高肝功能，使SAP大鼠体内内毒素被肝组织有效清除。此外，低、中、高剂量的栀子苷均能显著提高SAP大鼠血清SOD水平，降低血清MDA、IL-1β、TNF-α水平，提示栀子苷在SAP大鼠体内可发挥抗氧化应激和抗炎的作用。

转录因子Nrf2在生理条件下被负调控因子Keap1结合，处于灭活状态，受到刺激后被Keap1释放而激活，Nrf2活化后通过结合ARE转化到细胞核，启动下游靶基因如HO-1的转录，调节抗氧化应激反应。凌林等[12]研究发现，芍药苷能改善脓毒症引起的急性肺损伤，其机制与激活Nrf2/Keap1信号通路，降低组织氧化应激、炎症水平有关。杨永康等[13]研究显示，丹参提取物保护SAP肺损伤大鼠的肺组织，其机制与激活Nrf2/ARE信号通路，降低氧化应激反应有关。本研究显示，低、中、高剂量的栀子苷均能提高SAP大鼠肝组织中Nrf2、Keap1、HO-1蛋白表达水平，提示栀子苷可能通过激活Nrf2/Keap1/ARE通路，降低SAP大鼠体内氧化应激、炎症水平，进而减轻SAP大鼠肝组织损伤并提高肝功能，有效清除体内的内毒素。

综上所述，栀子苷通过激活Nrf2/Keap1/ARE通路，抑制氧化应激及炎症反应，对SAP大鼠的肝组织发挥保护作用，但后续还需进一步验证并完善栀子苷保护SAP大鼠肝组织的相关通路，为栀子苷治疗SAP提供更全面的机制。