乙酰唑胺对低氧应激下SD 大鼠肺泡膜通透性的影响

杜忠蕾，Muhammad Shoaib Tahir，高 源，马倩倩，朱沁芳，刘 杰，刘美恒，张 欢，张 伟

1 青海大学医学院，青海西宁 810001；2 高原医学教育部重点实验室，青海西宁 810001；3 黑龙江省牡丹江市第二人民医院，黑龙江牡丹江 157000；4 江苏省淮安市第一人民医院，江苏淮安 223300

急进高原后，面对突然的低压低氧环境，机体可产生应激反应，反应的失衡易发生急性高原病(acute mountain sickness，AMS)[1-2]。高原肺水肿(high altitude pulmonary edema，HAPE)是一种威胁急进高原人群生命健康的重症AMS。HAPE主要是由于肺动脉血管不均匀收缩导致肺循环压力增加而引起的一种非心源性水肿[3-4]，至今HAPE 发生机制不明确。水通道蛋白(aquaporin，AQP)中AQP1、AQP5 作为肺泡毛细血管膜上的主要水通道蛋白，为肺泡与毛细血管之间的水份运输提供了主要途径，在肺内液体清除中起到了关键作用[5-7]。二者表达的变化会影响肺泡膜的通透性，在HAPE 的发病中起着一定的促进作用。国外学者一直认为乙酰唑胺(acetazolamide，AZ)是预防AMS 的首选药[8]。但到目前为止，AZ 预防HAPE 的具体机制尚不清楚，本课题拟通过构建HAPE 动物模型，探讨AZ 在低氧应激下对大鼠肺泡膜通透性的影响。

材料与方法

1 主要材料及仪器 乙酰唑胺粉剂(RS-Sigma，A6011-25G)；HE 染色试剂盒(Solarbio，G1120)；Anti-Aquaporin 1(Abcam，ab65837)；Anti-Aquaporin 5 (Abcam，ab78486)；Rat IL-6 ELISA Set (Bdbiosciences，Cat.No.550319)；2-step plus Poly-HRP Anti Rabbit IgG Detection System (Elabscience E-IR-R215)，实验动物低压模拟舱(西安富康空气净化设备工程有限公司，型号：HCPⅢD800)，手持式血液分析仪(Flextronics 公司，300-G)，血气生化多项测试卡片(美国雅培床旁监护有限公司，N20319)，酶联免疫检测仪(帝肯上海贸易有限公司，Infinite M200 PRO)、石蜡切片机(德国莱卡仪器有限公司，LEICA RM2235)、光学显微镜(Olympus 公司)，实时荧光定量PCR 仪(Bio-rad，CFX96)。

2 实验动物及造模 由北京维通利华实验动物技术有限公司购入健康雄性SD 大鼠(6～8 周龄，体质量199.60±8.27 g)，许可证号：SCXK(京)2019-0004。所有大鼠置于青海大学医学院动物房通风橱中饲养(室温20℃～23℃，相对湿度40%～45%，昼夜交替；自由摄取标准维持颗粒饲料和水)。本课题组的前期研究及相关文献表明，在模拟海拔7 000 m 缺氧暴露2 d 肺水肿持续发展[9-10]。适应性饲养7 d 后按照不同处理方式分为4 组，每组12 只：对照组(CN 组，海拔2 260 m)、低氧组(H7K 组，海拔7 000 m)、乙酰唑胺组(NAZ 组，海拔2 260 m)、低 氧+乙酰唑胺组(HAZ 组，海拔7 000 m)。NAZ 组与CN 组置于西宁海拔2 260 m(大 气 压574 mmHg，PO2120.1 mmHg；1 mmHg=0.133 kPa)；NAZ 组、CN 组分别给予1%AZ (50 mg/kg)、0.9%氯化 钠注射液(45 mg/kg)灌胃(Bid，5 d)。HAZ 组与H7K 组置于模拟海拔7 000 m 的低压氧舱中2 d(大气压305 mmHg，PO263.7 mmHg)；HAZ、H7K 组分别给予1% AZ(50 mg/kg)、0.9%氯化钠注射液(45 mg/kg)灌胃(Bid，入舱前3 d 和舱内2 d)。4 组大鼠均灌胃5 d后取材。

3 动脉血气测定 每组大鼠12 只造模结束后，予20%乌拉坦注射液0.7 mL/100 g，腹腔注射，麻醉成功后将动物仰卧固定，打开腹腔，腹主动脉取血0.2 mL 立即测动脉血气。

4 测定血清中白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)浓度 每组大鼠12 只，抽取腹主动脉血液约8 mL，静置2 h 后离心(3 000 r/min，10 min)，留取血清，采用ELISA 法检测血清中IL-6、TNF-α 浓度。

5 测定大鼠的肺组织含水量 采血结束后，每组取6 只大鼠，打开胸腔，暴露并分离取出肺组织。取少量左肺下叶4%多聚甲醛固定，剩余左肺组织-80℃冰箱冻存后用于其他指标检测。右侧肺叶吸干表面水分后用精密电子天平快速称量，计为湿重(W)，将右肺组织置80℃恒温烤箱，干燥72 h 直至恒干重(平均称重误差＜0.002 g)后再称量，计为干重(D)，计算右肺组织湿重与干重质量比值(W/D)，表示肺组织水肿情况。

6 测定支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中IL-6、TNF-α 含量 每组剩余6 只大鼠，结扎左侧支气管并留存左肺组织(处理同上)。在气管分叉处插入气管插管，用预冷灭菌的0.9%氯化钠注射液缓慢灌洗右肺，每次2 mL，重复3 次，回收后混匀，回收率＞60%，离心(1 500 r/min，15 min)取上清，ELISA 法测定BALF中IL-6、TNF-α 浓度。

7 qRT-PCR方法检测肺组织中AQP1、AQP5 mRNA 的相对含量 从-80℃冰箱中提前取出已冻存的大鼠左肺组织(每组12 只)，并称量约0.1 g，按Trizol 试剂说明提取肺组织的总RNA 并测得OD 值，根据PCR 反应试剂盒的操作流程逆转录反应，采用CFX96 实时荧光定量PCR 仪进行三步法扩增检测各组AQP1、AQP5 mRNA 表达量。实验所得数据采用2-ΔΔct法进行相对定量分析。qRTPCR 引物(恒硕生物工程股份有限公司合成)序列5'-3'，AQP1-F：AAGCCATGTTTGGCCACTTCA；AQP1-R：GGCCCTTAGCCATTGTCCAG；AQP5-F：CCATGGTGGTGGAGTTAATCTTGA；AQP5-R：CATGGAACAGCCGGTGAAGTAG；Actin-F：CCTAAGGCCAACCGTGAAAA；Actin-R：CAGA GGCATACAGGGACAACAC。

8 苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织形态学变化 各组肺组织标本经4%多聚甲醛固定2 d 后石蜡包埋并切片(厚度为5 µm)，HE 染色、固定，于Olympus 光学显微镜观察并摄片。

9 免疫组化观察肺组织中AQP1、AQP5 的表达左肺组织标本经固定、石蜡包埋、切片后，脱蜡、水化组织切片并进行抗原热修复，用0.lmol/L 的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)稀 释AQP1(1∶400)和AQP5(1∶200)一抗并孵育后，再按照二步法免疫组化试剂盒的使用步骤进行操作，封片后使用Olympus 光学显微镜观察，摄片，细胞膜上出现黄、棕色为阳性细胞。

10 统计学方法 实验数据使用统计软件SPSS27.0进行分析，计量资料以±s表示，各组间的数据比较应用单因素方差分析，两两比较采用LSD 法。以双侧α=0.05 为检验水准。

结果

1 大鼠动脉血气分析 各组大鼠造模结束后通过腹主动脉采集动脉血进行血气分析对比，结果显示，与CN 组比较，NAZ 组、H7K 组和HAZ 组的大鼠动脉血pH 值下降(P＜0.05)；H7K 组的大鼠动脉血PaO2明显降低(P＜0.05)，而HAZ 组PaO2得到改善(P＜0.05)。见表1。

表1 大鼠动脉血气分析结果Tab.1 The arterial blood gas testing results of rats

2 肺组织含水量：W/D 比值的结果分析 H7K 组右肺W/D 比值高于CN 组(P＜0.05)。与H7K 组比较，HAZ 组的W/D 比值降低(P＜0.05)。见图1。

图1 采用湿/干重比测定各实验组大鼠的肺组织含水量(aP＜0.05，vs CN 组；bP＜0.05，vs NAZ 组；cP＜0.05，vs H7K 组)Fig.1 The lung water content of rats in different experimental groups was measured using the wet/dry weight ratio(aP＜0.05,vs CN group;bP＜0.05,vs NAZ group;cP＜0.05,vs H7K group)

3 ELISA 检测BALF 及血清中IL-6、TNF-α 含量变化 与CN 组相比较，H7K 组的大鼠血清及BALF 中IL-6、TNF-α 的 含 量均升高(P＜0.05)。HAZ 组IL-6 的含量较H7K 组降低(P＜0.05)。H7K 组与HAZ 组BALF 中TNF-α含量无统计学差异。见图2、图3。

图2 ELISA 法检测BALF 中IL-6 和TNF-α 浓度(aP＜0.05，vs CN 组；bP＜0.05，vs NAZ 组；cP＜0.05，vs H7K 组)Fig.2 The concentration of IL-6 and TNF-α in BALF were determined by ELISA (aP＜0.05,vs CN group;bP＜0.05,vs NAZ group;cP＜0.05,vs H7K group)

图3 ELISA 法检测血清中IL-6 和TNF-α 的浓度(aP＜0.05，vs CN 组；bP＜0.05，vs NAZ 组；cP＜0.05，vs H7K 组)Fig.3 The concentration of IL-6 and TNF-α in the serum were determined by ELISA (aP＜0.05,vs CN group;bP＜0.05,vs NAZ group;cP＜0.05,vs H7K group)

4 qRT-PCR 检测肺组织中AQP1、AQP5 mRNA的相对含量 与CN 组相比，H7K 组的肺组织中AQP1、AQP5 mRNA 表达量明显增加(P＜0.05)；与H7K 相比，给予乙酰唑胺预处理的HAZ 组，肺组织中AQP1、AQP5 mRNA 表达量降低(P＜0.05)。见图4。

图4 各组大鼠左肺组织AQP1、AQP5 mRNA 表达水平(aP＜0.05，vs CN 组；bP＜0.05，vs NAZ 组；cP＜0.05，vs H7K 组)Fig.4 mRNA expression levels of AQP1 and AQP5 in lung tissues(aP＜0.05,vs CN group;bP＜0.05,vs NAZ group;cP＜0.05,vs H7K group)

5 各组肺组织HE 染色的形态学观察 CN 组及NAZ 组肺泡腔清晰，肺泡间隔未增宽、肺泡腔内无出血；与CN 组比较，暴露在低氧2 d 的H7K组肺泡上皮细胞明显肿胀，肺泡间隔增宽伴有炎细胞浸润，肺间质水肿；与H7K 组比，HAZ 组肺间质水肿和炎细胞浸润均有所减轻。如图5。

图5 SD 大鼠的肺组织HE 染色图(40×；红色箭头指示肺间隔增宽、内皮细胞肿胀等情况)Fig.5 HE staining of lung tissue sections of SD rats (40×;red arrows indicate widening of lung septa,swelling of endothelial cells,and so on)

6 肺组织中AQP1、AQP5 蛋白表达免疫组化 检测出细胞膜上出现黄、棕色染色为阳性细胞。光镜观察：CN 组的肺组织切片可见部分血管内皮细胞及肺泡上皮细胞染色呈黄棕色。H7K 组肺泡膜上的上皮细胞棕黄色颗粒较CN 组增加。HAZ 组AQP1 和AQP5 阳性表达低于H7K 组(P＜0.05)(图6A)。在每组切片中随机取6 个视野，使用ImageJ 软件测得IOD 值进行数据分析。H7K 组IOD 值高于CN 组、NAZ 组，差异有统计学意义(P＜0.05)；应用乙酰唑胺的HAZ 组IOD 值较H7K 组降低且有统计学差异(P＜0.05)(图6B)。

图6 肺组织中AQP1 和AQP5 的表达(免疫组化法。aP＜0.05，vs CN 组;bP＜0.05，vs NAZ 组;cP＜0.05，vs H7K 组) A：显微镜下观察(40×)；B：各组AQP1 和AQP5 IOD 数值Fig.6 Expression levels of AQP1 and AQP5 in lung tissues of rats (immunohistochemical methods.aP＜0.05,vs CN group;bP＜0.05,vs NAZ group;cP＜0.05 vs H7K group) A:microscopic observation (40×);B:AQP1 and AQP5 IOD values in each group

讨论

本研究探讨了乙酰唑胺对低氧应激下SD 大鼠肺泡膜通透性的影响，结果显示在模拟海拔7 000 m(305 mmHg，PO263.7 mmHg)的低压氧舱中持续2 d 低氧暴露后，SD 大鼠动脉血PaO2下降，肺组织病理切片可见肺间质水肿、炎细胞浸润，肺组织W/D 升高。通过以上指标与组织学分析，可以判断H7K 组的肺组织出现了典型的间质性肺水肿，肺水含量显著增加，提示大鼠HAPE模型成功建立。

HAPE 是与高原低氧有关的致死性高原病，HAPE 的发生取决于海拔高度的易感性[11]。其主要的病理生理改变是非心源性肺水肿，高原低氧引起肺动脉高压过度灌注以及局部肺血管不均匀收缩导致血管渗漏[12]。低氧应激引起肺泡膜通透性发生改变，降低了肺泡液体清除率，导致肺泡内液体聚积，已经被认为是HAPE 发病的病理生理学机制[13]。大量液体进入肺间质，致肺泡上皮细胞出现主动重吸收功能障碍，使肺泡内液体过度积聚，最终发生HAPE[14]。减轻肺水肿是改善高原肺水肿预后的重要治疗靶点，应用药物防治仍是首选[15]。

pH、PaCO2、PaO2和HCO3-是判断血氧和酸碱平衡的常用指标。本实验通过低压氧舱模拟急性低氧的大鼠模型，各组大鼠进行动脉血气对比显示H7K 组的大鼠动脉血pH、PaO2及HCO3-水平较CN 组降低，缺氧引起肺通气量增加以维持肺泡PaO2水平，而过度通气会进一步导致PaCO2急剧下降[16]，与国内一些学者研究结果一致[17]。有研究认为，AZ 作为强效碳酸酐酶抑制剂，通过减少肾小管回收HCO3-，增加肾排泄碳酸氢盐，引起代谢性酸中毒，进而使肺泡通气量增加，提高动脉血氧含量[18-19]，并能抑制缺氧导致的炎症反应及肺血管收缩，降低肺动脉压[20]。本实验结果表明AZ 对模拟海拔7000m 低氧2d 的大鼠PaO2有所改善。

肺含水量是肺水肿严重程度的指标。湿干重法与肺水肿轻重程度呈正相关[21]。本实验中H7K组的大鼠与CN 组相比，其右肺W/D 比值增高(P＜0.05)。实验结果与Lee 等[22]的结果一致。本研究结果显示，预防应用AZ 的HAZ 组右肺W/D较H7K 组降低。这说明AZ 可明显改善肺水肿。

炎症反应在高海拔疾病的发生发展中起着至关重要的调控作用[18,23]。低氧应激过程中可诱发肺组织发生非细菌性炎性反应、激活肺泡巨噬细胞等炎症细胞，促进IL-6、TNF-α 等炎症介质释放，造成肺泡膜的损伤并使之通透性增高[24]。本实验中H7K 组的大鼠BALF 及血清中IL-6、TNF-α水平较CN 组升高，HAZ 组的大鼠BALF 及血清中TNF-α、IL-6 水平较H7K 组降低，说明AZ 在抑制炎症连锁反应方面有一定效果。

AQP 是位于细胞膜上的一组选择性水通道蛋白。相关研究表明，AQP1 和AQP5 作为肺组织中主要的水通道蛋白，是通过肺毛细血管内皮和肺泡上皮进行水份运输的主要途径[25]。AQP1 主要表达在肺毛细血管内皮上，AQP5 主要分布于Ⅰ型肺泡上皮细胞，二者的表达量变化与肺内液体清除能力密切相关。AQP1、AQP5 的过度表达可使水快速通过肺毛细血管内皮及肺泡上皮引起肺间质水份增多。Bärtsch 等[26]报道炎症因子可能在细胞模型中促进AQP 的表达。水通道蛋白的调控可能使核转录因子NF-κB 的活化增加并在低氧的环境下表达上调。在本实验中模拟海拔7 000 m 环境下2 d 大鼠的肺组织中AQP1、AQP5 mRNA 及蛋白表达水平显著增加，这与Wang 等[5]的研究一致。AZ 作为一个经典药物，常用于青光眼的治疗，通过减少房水的产生而降低眼压，也有抗炎作用。AZ 与AQP 有着密切的关系，已经证明其通过与AQP1 相互作用，抑制AQP1 的表达从而减少水渗透[27-28]。在本实验中我们发现HAZ 组的肺组织中AQP1 和AQP5 均较H7K 组有所下降。AZ 通过减少肺泡膜AQP1、AQP5 的表达，影响肺泡上皮细胞的液体转运和肺水平衡，从而发挥防治HAPE 的作用。

综上所述，动物低压氧舱模拟海拔7 000 m 环境下2 d 可使SD 大鼠肺泡膜通透性增加，引起肺水肿，同时伴有BALF 及血清中IL-6、TNF-α 含量增加，肺组织中AQP1、AQP5 表达水平增加。乙酰唑胺预处理可有效缓解大鼠肺水肿，减轻低氧应激下炎症因子IL-6、TNF-α 的释放及肺组织中AQP1、AQP5 的表达，降低低氧应激下大鼠肺泡膜通透性。然而，本实验的样本量少且存在一定的局限性，未来可能通过靶向调节AQP1、AQP5的表达来深入研究HAPE 的具体分子机制，发现更有效的防治药物。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。