丙酸钠对脂多糖诱导的急性肺损伤大鼠氧化应激和炎症的影响

张婷婷，向小琴，钟江姗，桂雪梅，范贤明

西南医科大学附属医院 呼吸与危重症医学科，四川泸州，646000

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)有着高发病率和高死亡率的特点，其特征是弥漫性肺浸润、毛细血管通透性增加、气体交换受损和肺部炎症，导致一种以低氧为主的急性呼吸衰竭综合征[1]。目前针对ALI 的治疗除了一般支持疗法外，还有一些抗炎药、抗氧化剂、抗凝剂、表面活性剂和神经肌肉阻滞剂等，这些并不能显著提高ALI 患者的生存率和生活质量[2]。ALI 的病理生理基础多种多样，包括免疫细胞过度激活、“细胞因子风暴”、氧化应激、炎症、缺氧、电解质紊乱等[3]，其中氧化应激和炎症反应至关重要。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可与细胞表面的Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)结合，经过一系列的反应，最终激活以NF-κB 为主的核内因子，进而产生级联放大效应，形成复杂的系统炎症反应[4]，与此同时氧化应激信号可以通过激活Nrf2 而调节LPS 所诱导的炎症反应[5]。最近的研究表明，肠道微生物组可能在肠道以外其他疾病的发病机制中发挥重要作用[6]。这与肠道微生物群产生的短链脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)有关，这些脂肪酸可以在远处器官引起免疫调节变化[7]。其中，丙酸盐具有抗炎和抗氧化的作用[8]，丙酸盐可以显著调节体外和体内肺免疫反应，肠道微生物组丙酸盐产生增加与肺部炎症减少有关[9]，此外研究还发现丙酸钠(sodium propionate，SP)对LPS 诱导的肺损伤具有抗炎作用[10]。然而，目前尚不清楚丙酸盐如何在内毒素相关的肺部疾病中发挥作用。因此，本研究的目的是探讨丙酸盐减轻LPS 诱导的ALI 大鼠肺损伤具体机制，为ALI 的治疗提供新的思路。

材料与方法

1 实验动物 20 只健康8 周龄雄性SD 大鼠，体质量(200±20) g，购自西南医科大学动物实验中心，动物生产许可证号：SYSK(川)2018-065。大鼠饲养于SPF 级环境，室温(25±5)℃、湿度40%～60%，大鼠在实验期间自由饮水和摄食。

2 实验试剂 脂多糖和丙酸钠(Sigma 公司)；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)，IL-10 ELISA 试剂盒(ELK Biotechnology 公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)ELISA 试剂盒(南京建成生物工程研究所)；BAC 蛋白定量试剂盒(ASPEN 公司)；RIPA 总蛋白裂解液(ASPEN 公司)；核转录因 子NF-κBp65、核转录因子p-NF-κBp65、Keap1、NF-E2 相关因子2(Nrf2)兔源单克隆抗体及羊抗兔二抗(ASPEN 公司)；ECL 化学发光检测试剂盒(ASPEN 公司)。

3 动物分组及模型建立 适应性喂养1 周后，将SD 大鼠随机分模型组、低剂量SP 组、高剂量SP 组、对照组，每组5 只大鼠。低剂量SP 组和高剂量SP组分别给予300mg/kg、500mg/kg的SP 灌胃，相同条件下，模型组和对照组给予等量的0.9%氯化钠注射液灌胃，1 次/d，持续7 d。最后一次灌胃30min 后予以10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，在大鼠充分麻醉后，模型组和SP 组通过气管内滴注LPS(5 mg/kg)的方法制备ALI 模型；相同条件下，对照组气管内滴注等体积0.9%氯化钠注射液。造模完成后6 h 处死大鼠，收集腹主动脉血、肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、肺组织。

4 大鼠动脉血氧分压(PaO2)、肺湿/干质量比(W/D)测定 抽取大鼠腹主动脉血，用血气分析仪检测PaO2。取右肺组织，用PBS 冲洗干净，用滤纸吸干表面水分，称取肺湿重(W)；随后将该肺组织放置于70℃烤箱内72 h 直至完全脱水，再次称取肺质量，为肺干重(D)，计算相应的肺组织湿/干重比值(W/D)。

5 大鼠肺组织病理学观察 剪取大鼠左肺上叶组织小块，用PBS 冲洗干净，用甲醛固定，石蜡包埋，切成5 µm 厚片，HE 染色。在光学显微镜(200×)下随机选取5 个视野， 按照肺泡水肿、肺泡内充血、炎症细胞浸润、肺间质水肿程度评分，无改变或轻微改变为0 分，轻度改变为1 分，中度改变为2 分，重度改变为3 分，极重度改变为4 分，以平均值作为每个样本的肺损伤病理学评分[11]。

6 大鼠血清和BALF 的收集及细胞因子的测定抽取大鼠腹主动脉血5 mL；打开胸腔，分离出大鼠颈部气管，结扎气管及右主支气管，抽取无菌冰氯化钠溶液2 mL 缓慢注入肺内，反复抽注5 次，收集BALF。将取得的血液及BALF 样本分别在4℃下以3 000 r/min 离心10 min 后收集上清液。按照对应的ELISA 检测试剂盒说明书测定血清和BALF 中TNF-α、IL-6、IL-10 的浓度。

7 大鼠肺组织中MDA、SOD 水平测定 取适量肺组织，制备成组织匀浆。参照相应试剂盒说明书，用黄嘌呤氧化酶法测肺组织SOD 活力，用硫代巴比妥酸法测肺组织MDA 含量。

8 Western blot 法检测肺组织NF-κB p65、p-NFκB p65、Keap1、Nrf2 蛋白的表达 取适量肺组织，加入总蛋白裂解液，提取出总蛋白，用BCA 法测定所提蛋白的浓度，将各组蛋白浓度调整一致，然后加入5×蛋白上样缓冲液，95℃～100℃沸水浴5 min。制胶，每孔上样后进行电泳、转膜。5%脱脂奶粉封闭PVDF 膜1 h 后加入一抗4℃过夜。PBST 洗膜3 次后，加入二抗，室温孵育30 min，用TBST 在室温下摇床上洗4 次。加入适量的ECL 发光液曝光分析。

9 统计分析方法 应用SPSS26.0 统计分析软件，计量数据以±s表示，组间差异采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

1 各组大鼠动脉血PaO2比较 与对照组相比，模型组大鼠动脉血PaO2明显降低(P＜0.05)，不同剂量的SP 可显著提高大鼠动脉血PaO2值(P＜0.05)，且高剂量SP 组动脉血PaO2提高更明显(P＜0.05，表1)。

2 各组大鼠肺W/D 值比较 与对照组相比，模型组大鼠肺组织W/D 值明显升高(P＜0.05)，不同剂量的SP 可显著降低大鼠肺组织W/D 值(P＜0.05)，且高剂量SP 组W/D 值降低更明显(P＜0.05，表1)。

3 各组大鼠肺组织病理学及评分 HE 染色结果显示，对照组大鼠肺组织结构清晰完善，肺泡和肺间质无水肿，肺泡腔无明显充血、出血及炎症细胞浸润；与对照组相比，模型组大鼠肺组织结构紊乱，肺泡水肿明显，肺泡腔出血，伴有炎症细胞广泛浸润，肺泡间隔明显增厚；而SP 组肺组织结构较LPS 组更清晰，且肺泡腔内红细胞、炎症细胞减少，渗出减轻，肺泡间隔增厚减轻，高剂量SP 组较低剂量SP 组病理改善更明显(图1)。与对照组相比，模型组大鼠肺损伤病理学评分值明显升高(P＜0.05)，SP 组可显著降低大鼠肺损伤病理学评分值(P＜0.05)，且高剂量SP 组病理学评分值较低剂量SP 组降低更明显(P＜0.05，表1)。

表1 各组大鼠PaO2、W/D、肺损伤病理学评分变化(n=5)Tab.1 PaO2,W/D and lung pathological score of mice (n=5)

图1 SP 在LPS 诱导的急性肺损伤大鼠中对肺组织HE 染色的影响 (HE，200×) A:Control group;B:Model group;C:SP (300 mg/kg)group;D:SP (500 mg/kg) groupFig.1 Effect of SP on HE staining of lung tissue in LPS-induced acute lung injury rats (HE,200×) A:control group;B:model group;C:SP (300 mg/kg) group;D:SP (500 mg/kg) group

4 各组大鼠肺组织氧化指标比较 与对照组相比，模型组大鼠肺组织中氧化指标MAD 含量升高(P＜0.05)，抗氧化指标SOD 活性降低(P＜0.05)，低、高剂量的SP 使大鼠肺组织的MAD 含量降低(P＜0.05)，SOD 活性增加(P＜0.05)；与低剂量SP 组对比，高剂量SP 组大鼠肺组织MAD含量降低，SOD 活性增加更明显(P＜0.05，图2)。

图2 SP 对肺组织MDA 含量和SOD 活性的影响[aP＜0.05,vs control group;bP＜0.05,vs LPS group;cP＜0.05, vs SP(300 mg/kg)]Fig.2 Effects of SP on MDA content and SOD activity in lung tissue(± s,n=5) (aP＜0.05,vs control group;bP＜0.05,vs LPS group;cP＜0.05, vs SP [300 mg/kg])

5 各组大鼠血清和肺泡灌洗液炎症因子含量比较与对照组相比，模型组大鼠血清和肺泡灌洗液中的促炎因子IL-6、TNF-α 均显著升高(P＜0.05)，同时抗炎因子IL-10 呈应激性增加(P＜0.05)；经SP 干预后，大鼠血清和肺泡灌洗液中的IL-6、TNF-α 显著降低(P＜0.05)，IL-10 显著升高(P＜0.05)；与低剂量SP 组相比，高剂量SP 组大鼠血清和肺泡灌洗液中的IL-6、TNF-α 降低，IL-10 升高更明显(P＜0.05，图3)。

图3 SP 对急性肺损伤大鼠血清和BALF 中IL-6、TNF-α、IL-10 浓度的影响[aP＜0.05,vs Control group;bP＜0.05,vs LPS group;cP＜0.05,vs SP (300 mg/kg)]Fig.3 Effects of SP on IL-6,TNF-α,IL-10 content in serum and BALF of mice with acute lung injury (n=5) (aP＜0.05,vs control group;bP＜0.05,vs LPS group;cP＜0.05, vs SP [300 mg/kg])

6 各组大鼠肺组织中NF-κB、p65、p-NF-κB p65、Keap1、Nrf2 蛋白的表达比较 与对照组相比，模型组大鼠肺组织p-NF-κB p65 和Keap1 蛋白表达水平升高(P＜0.05)，而Nrf2 蛋白表达水平降低(P＜0.05)；低、高剂量的SP 可使p-NF-κB p65 和Keap1 蛋白表达水平降低(P＜0.05)，使Nrf2 蛋白表达水平升高(P＜0.05)，且高剂量SP 组肺组织p-NF-κB p65 和Keap1 蛋白表达水平降低，Nrf2 蛋白表达水平升高更明显(P＜0.05，图4、图5)。

图4 SP 对急性肺损伤大鼠NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白表达的影响[aP＜0.05,vs Control group;bP＜0.05,vs LPS group;cP＜0.05, vs SP (300 mg/kg)]Fig.4 Effect of SP on the expression of NF-κB p65,p-NF-κB p65 proteins in LPS-induced mice (n=3) (aP＜0.05,vs control group;bP＜0.05,vs LPS group;cP＜0.05, vs SP [300 mg/kg])

图5 SP 对急性肺损伤大鼠肺组织Keap1、Nrf2 蛋白表达的影响[aP＜0.05,vs Control group;bP＜0.05,vs LPS group;cP＜0.05, vs SP (300 mg/kg)]Fig.5 Effect of SP on the expression of Keap1,Nrf2 proteins in LPS-induced mice (n=3) (aP＜0.05,vs control group;bP＜0.05,vs LPS group;cP＜0.05, vs SP [300 mg/kg])

讨论

ALI 是一种严重的肺实质疾病，表现为进行性的呼吸困难，逐渐进展为呼吸窘迫综合征，导致严重的临床并发症及高死亡率[12]。引起ALI 的病因复杂，包括感染因素和非感染因素，临床以感染因素为主。LPS 是革兰阴性菌细胞外膜的主要成分，可刺激肺部炎性细胞募集与激活，导致系统性的炎症反应和免疫激活，产生组织损伤[13]。LPS 诱导的ALI 模型与人类ALI 病理过程的相似[14-15]。本实验采用气管内滴注LPS 方式建立ALI 模型，模型组大鼠肺组织病理变化表现为肺泡出血、肺泡组织破坏、肺泡间隔增厚、炎细胞浸润，可见模型建立成功，并且通过低氧血症、肺组织W/D 升高、炎性因子产生增加等进一步证实。此外，在不同剂量的SP 干预ALI 大鼠后，SP 组大鼠肺组织病理损伤明显减轻、W/D 降低、低氧和严重的炎症状态明显改善，显示出SP 对LPS 诱导的ALI 大鼠的保护作用，并呈一定的剂量依赖性。

SCFAs 主要由在小肠中不被消化和吸收的碳水化合物的糖酵解产生，主要产物为醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐。丙酸盐在调节气道和肺部炎症方面起着关键作用[16]。ALI 的本质是炎症反应，其中，NF-κB 信号通路具有重要作用[17]。研究发现，LPS 可以激活NF-κB 信号通路，促进TNF-α、IL-6 等炎症因子的产生和释放[18]。NF-κB 蛋白通常以同源或异源复合物的形式存在，在静息状态下，细胞质中的p50/p65 与其抑制物IκB 结合，处于非活性的状态，而当细胞受到外源性信号刺激后，IκBα 被磷酸化，发生降解，释放出p50/p65，进入细胞核内，诱导靶基因的表达[19]。在本研究中，LPS增加了p65磷酸化和p65NF-κB核易位，这些均被SP 所抑制，同时我们发现暴露于LPS 的大鼠血清和肺泡灌洗液中促炎因子TNF-α、IL-6 的表达增加，抗炎因子IL-10 呈应激性增加，然而SP 给药降低了这些促炎因子的水平，提高了抗炎因子的水平。由此推测，SP 可能通过抑制NF-κB 信号通路而发挥抑制炎症的作用。

氧化应激是ALI 发展的重要因素，目前已有多项研究证明具有抗氧化应激作用的药物对ALI 具有保护作用[20-22]。Nrf2 在维持抗炎和抗氧化中起关键作用，一旦被激活，Nrf2 可以从Keap-1中释放，然后转移到细胞核，与抗氧化反应元件(antioxidant reaction element，ARE)结合，调节下游靶基因NQ01、HO-1 和 GCLC 等的表达转录，从而发挥抗炎、抗氧化作用[23]。研究显示，Nrf2可以抑制NF-κB，从而发挥抗炎作用[24]。本研究中，SP 给药后，Keap1 表达降低，而Nrf2 的表达升高，提示Nrf2/Keap1 信号通路明显被激活，并且肺组织中氧化指标MDA 浓度降低、抗氧化指标SOD 浓度升高也证明了这一结果。由此推测，SP 可能通过抑制Nrf2/Keap1 信号通路从而发挥抗氧化和抗炎作用。

综上所述，本研究表明SP 可以减轻LPS 诱导的ALI，并且这种保护作用呈一定的剂量依赖性。SP 可以减少炎症和氧化应激损伤，其机制可能是调节Keap1/Nrf2 信号通路，抑制NF-κB，减轻肺的炎症和氧化应激，从而改善ALI。但后续还需进一步验证、完善SP 改善ALI 的最佳剂量和其他可能参与的通路，为SP 治疗ALI 提供更全面的理论依据。