微生物生产谷胱甘肽的国内研究进展(1990—2020)

2022-06-09刘秀继覃先武邓张双

三峡大学学报(自然科学版) 2022年4期

刘秀继邹群覃先武邓张双

(1.中国轻工业功能酵母重点实验室(三峡大学生物与制药学院)，湖北宜昌 443002;2.安琪酵母股份有限公司研究院，湖北宜昌 443003)

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是由甘氨酸、半胱氨酸和谷氨酸缩合而形成的三肽，在自然界中以还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)两种形式存在，其中氧化型谷胱甘肽由还原型谷胱甘肽通过巯基缩合生成二巯键形成.GSH是一种重要的细胞调节代谢物质、药物试剂和功能性添加剂，在医药、食品、化妆品、动物营养等领域广泛应用，市场前景广阔.GSH来源于富含生物体的提取[1-2]、化学合成[3]、生物酶法合成[4]和微生物发酵[5]，其中酵母细胞发酵生产GSH被广泛应用于工业制备.日本协和发酵工业株式会社(KYOWA)基本垄断GSH全球市场并形成生产技术壁垒，国内部分生物发酵企业通过引进国外专利技术，已实现国内生产和市场销售，但产量和利润多受限于富含GSH酵母发酵技术、发酵(原材料)成本和技术转让成本.

本文以CNKI和CNIPA为数据源，采用篇名和发明名称为检索条件，以“谷胱甘肽”为检索词，检索日期为1990—2020年，分别检索学术期刊和中国发明专利，共检索到5627条文献和1122项专利.围绕“微生物菌种选育、发酵调控、纯化方法”等研究领域作进一步筛选，最终筛选出样本文献和专利共计170篇，并作归纳总结，旨在帮助相关研究人员快速了解微生物生产谷胱甘肽进展以及探索新的研究领域.

1 生产谷胱甘肽的微生物菌种选育[6-51]

见表1，生产谷胱甘肽的微生物菌种主要包括:藤黄八叠球菌(Sarcineluted)、南极衣藻(Chlamydomonassp.)、南极硅藻(Berkeleyaruti lans)、南极绿藻(Chlorophyceae)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactisssp.)、酿酒酵母(Saccharomycescere-visiae)、产朊假丝酵母(Candidautilis)、荧光假单胞菌(Pseudomonassp.)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyce Spombe，S.promb)、Candidacarpophila以及转入GSH生物合成酶基因的工程菌，现有报道生产菌种多为酿酒酵母菌和以酵母或大肠杆菌为载体的基因工程菌.

表1 生产谷胱甘肽微生物菌种选育

续表1 生产谷胱甘肽微生物菌种选育

在菌种选育方面，野生型菌株多来源于土壤与水体微生物、植物与昆虫共生菌、极地冰藻等.诱变方式多采用紫外诱变、化学诱变、等离子体诱变、激光诱变、γ射线诱变、航天育种、原生质体融合等单一或者联合多种方法处理，同时结合氯化锌、镉盐和乙硫氨酸等抗性筛选，获得高产GSH的突变株.通过选育，未优化培养条件，GSH产量最高可达到约900 mg/L;工程菌高度表达GSH合成酶，最高产量可达到约10 g/L.

2 生产谷胱甘肽的微生物发酵调控[52-109]

见表2，过去30年主要围绕酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和产朊假丝酵母(Candidautilis)开展发酵调控研究，包括:培养基优化(碳氮源、p H、金属离子等)、GSH合成前体氨基酸(L-半胱氨酸、L-谷氨酸和甘氨酸)的添加、流加与分批补料(如以控制比生长速率为目的的补糖策略)、代谢通量分析和代谢途径干预(3-磷酸甘油酸和A-酮戊二酸节点)、乙醇代谢反馈调控、外源刺激(如H2O2、Na2SO3、低p H等)胁迫调控、DO-srat组合反馈流加控制以及多菌(酿酒酵母与乳酸杆菌Lactobacilluscasei)共培养模式.其中较为高效的调控策略为:前体L-半胱氨酸分批补加策略、控制乙醇浓度的流加补糖策略、DO-srat反馈流加高密度发酵策略、低p H胁迫等，酵母细胞生产GSH能力得到大幅度提升.相较而言，转入GSH合成酶基因的大肠杆菌作为GSH生产菌，具备高产、稳定和副产物少等代谢调控优势.

表2 生产谷胱甘肽微生物发酵调控

续表2 生产谷胱甘肽微生物发酵调控

3 酵母中谷胱甘肽的纯化方法

3.1 提取方法[110-126]

见表3，目前从酵母细胞中提取GSH的方法包括:溶剂提取法，所用溶剂有乙酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、三氟乙酸、甲酸、乙醇等有机溶剂;热水抽提法，抽提时通过加入盐酸、醋酸等调节p H，提高GSH提取率和减少氧化反应发生，在此方法上进行改良的高压蒸汽法也多见报到;高压均质法，通过破坏酵母细胞壁，加速GSH溶出，一般配合低温操作;微波提取法和超声波破碎法，多见于理论研究;此外还有联用上述多种方法的组合法.

表3 酵母细胞中谷胱甘肽的提取

GSH分子量小且水中溶解度高，可以在不需要完全破碎细胞壁的情况下高效溶出.相比溶剂法和高压均质法，热水抽提法可以大大降低样品中大分子肽的含量，在后续柱层析中有效减少提取液中参与GSH竞争的大分子，同时降低膜过滤等设备使用损耗.因此，热水抽提法GSH提取率高，超过90%，且GSH氧化少;加上热水抽提法效率高、耗时少，经济、无污染，是从酵母中提取GSH的首选方法.

3.2 离子交换树脂纯化法[127-156]

提取的GSH溶液含有大量小分子氨基酸和肽类成分，性质与GSH相似，需作进一步分离纯化，目前常用的纯化方式为树脂法.针对复杂样品，提取液中大分子蛋白与GSH竞争吸附，在上柱之前宜采用超滤膜处理去除.

文献[157]报道，GSH等电点2.83.在低p H值(p H 1～2)下，GSH主要以GSH+形式存在;在等电点附近(p H 3)，主要以GSH±形式存在;在高p H值(p H 7)下，全部以GSH-形式存在，易氧化生成GSSG.因此，GSH分离需在p H＜3的酸性条件下进行.首选阳离子交换树脂分离纯化GSH，而弱酸性阳离子交换树脂工作p H为5以上，因此优选强酸型阳离子交换树脂.见表4，目前用于GSH分离纯化研究的阳离子交换树脂绝大多数为强酸型，包括D001，D001×7，001×7，005×7，732，D061，Amberlite IR120，D301和HD-8等，上述树脂工作p H宜为2～3，过低p H值，可能引起 H+与GSH+发生竞争吸附.针对酵母发酵液上样，上述树脂的GSH回收率范围为60%～70%.且上述树脂中研究最多的为D001，因其为大孔型强酸性阳离子交换树脂，除吸附性能，还兼具分子筛功能，对溶液中大分子量的物质(如GSH降解产生的多聚分子和色素)具有过滤除杂和脱色效果.阳离子树脂吸附GSH后常用的洗脱液为1%～3%的NaCl溶液，操作中一般采用串联诸如SP207的大孔树脂进行脱盐.有文献报道，针对高浓度谷胱甘肽溶液的处理，亦可单独使用SP207进行脱盐除杂操作，再进入浓缩结晶工艺.

表4 树脂在制备谷胱甘肽中的应用

续表4 树脂在制备谷胱甘肽中的应用

相对阳离子树脂而言，阴离子交换树脂用得较少，分离过程中使用阴离子交换树脂更多是使用其他功能，如脱盐.仍需注意的是，阴离子交换树脂在筛选过程中注重在2.0～4.5的工作p H范围内筛选.

近年来，借助与GSH的巯基发生化学反应，还开发了一些特异性提纯的螯合树脂，如D840、壳聚糖-铜螯合树脂、汞树脂和硫树脂，正因为与GSH特异性结合，所以可以直接用于提取液的处理，且GSH回收率高.但这类树脂仅限于实验室研究，未见推广应用.

3.3 其他纯化方法

除了交换树脂法，研究人员还开发了其他GSH纯化方法，如反胶束萃取法[158]、电解法[159]、磁性纳米材料吸附层析法[160]、壳聚糖吸附层析法[161]，部分方法具有发展潜力，如双水相萃取法[162]，具有提取率高的特点，但是目前还处于实验室研究阶段，未见推广应用.

传统的酵母制备GSH为铜盐法和树脂法结合分离纯化[163]，GSH中的胱氨酸上的巯基与Cu2+形成络合物从溶液中沉淀下来，达到富集目的，然后经解络合和树脂分离达到纯化目的.除了铜离子以外，其他过渡金属离子(Zn2+、Cd2+)也能与GSH发生络合反应[164]，但络合效率低.

3.4 检测方法

目前用于GSH检测的方法主要包括:荧光分光光度法[165]、毛细管电泳法[166]、电化学法[167]、高效液相色谱法[168]和DTNB法[169].其中DTNB与巯基的反应作为一种巯基蛋白(肽)含量测定方法被广泛应用，但应用该方法测定谷胱甘肽含量时易受测定溶液中其他游离巯基蛋白质、肽或者氨基酸的干扰，同时测定对象中的色蛋白存在也影响方法灵敏性.高效液相色谱法(HPLC)是一种快速、高效、高灵敏度的有机成分检测方法.针对以往HPLC法测定谷胱甘肽存在保留时间过短、易干扰等问题，研究人员探索了缓冲盐体系p H值对谷胱甘肽保留时间的影响，通过调节流动相p H值和二元相配比的方法，优化了酵母细胞中GSH和GSSG色谱检测方法，建立了一种改良的酵母细胞中谷胱甘肽高效液相色谱分析方法[170]，该方法被纳入《GB/T 35882—2018富营养素酵母》国家标准.

4 谷胱甘肽产业现状及展望

据不完全统计，GSH的全球销售量超过300吨/年，市场价值超过50亿元人民币，过去10年复合年增长率超过8%.近年来GSH市场增长率有所放缓，预计到2025年全球市场价值将超过55亿元人民币.美国、欧洲、中国和日本是主要的消费国家和地区，总消费量占全球90%以上.中国作为最大的消费国，消费市场占全球35%以上.

目前，GSH全球产能主要集中在日本和中国，包括日本协和发酵株式会社和中国山东金城医药.市售的GSH生产多采用酵母发酵提取法，日本协和最先开展微生物工业制备GSH，始于20世纪90年代，以低廉的发酵成本(上游原料糖蜜获取、高密度发酵技术)、高产菌种和高效提取技术形成了技术壁垒，而化学合成制备GSH成本高昂，生物合成法(或工程菌)制备GSH面临生物安全问题，上述种种原因致使我国企业很难通过降低成本和革新技术参与国际市场竞争.因此，我国生产企业和研究人员需要在丰富GSH产业链上的产品类型(加大产业链上副产物如GSSG、丁二酸、麦角甾醇等的二次开发)，以及降低生产成本(开发糖蜜来源、提高发酵技术和节能减排)上提升竞争力.

虽然当前GSH全球需求容量偏小(50亿人民币)且GSH原料药可能存在产能过剩和价格走低等问题，但是GSH能广泛应用于保健品(护肝)、医药(护眼)、化妆品(排毒美白)和食品(抗氧化和提高免疫力)等行业，涵盖的终端消费规模超过百亿元.此外，国内市场则刚起步，如国产品牌花青肽美系列、谷胱甘肽面膜肽谷幽兰、谷胱甘肽茶多酚片、甘酵亮等，并且谷胱甘肽的应用未来还可能拓展到生物肥和饲料添加剂领域，包括提高动物生长性能、繁育能力以及促进植物光合作用，起到增产和提高品质等作用，谷胱甘肽产业必将迎来更加广阔的市场前景.