正交试验优选槐角中槐角苷的提取工艺

徐兴楠，王伟明

(黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036)

槐角为豆科植物槐(SophorajaponicaL.) 的干燥成熟果实，性苦、寒，集中分布于河南、天津、河北、山东等地。槐角具有清热泻火、凉血止血之功效，临床用于肠热便血、痔肿出血、肝热头痛、眩晕目赤等症，现代研究发现槐角中含多种黄酮类化合物，其中槐角苷是槐角的主要活性成分之一[1-3]，常温下为白色精细粉末，药理研究表明槐角苷具有抗炎、抑制免疫、抗生育和雌激素样等作用[4-5]，可见槐角苷的开发潜力巨大。本研究以槐角苷得率和固形物纯度为指标，通过单因素和正交试验优化槐角中槐角苷的超声提取法工艺参数，以期为槐角苷的提取分离和生产工艺改进提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

槐角购自陕西兴盛德药业有限公司，经黑龙江省中医院科学院王伟明研究员鉴定为豆科植物槐SophorajaponicaL.的干燥成熟果实；槐角苷对照品(纯度>98%，批号：111695-201703，购自中国食品药品检定研究院)；津腾有机滤头(尼龙66)0.45 μm 滤膜；102新星中速滤纸；水为超纯水；甲醇、乙腈为色谱纯；95%乙醇为分析纯。

1.2 仪器与设备

AF-20A 1000g粉碎机(温岭市奥力中药机械有限公司)；ATC2-5-U 超纯水机(美国艾科浦国际有限公司)；KQ-800KDB高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；LC20AD-SPDM20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；BP211D型电子分析天平(德国赛多利斯集团)；LE2002E/02型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 槐角苷得率测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Agilent SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-乙腈-0.07%磷酸溶液(12∶20∶68)，柱温：室温，流速为1.0 mL/min，检测波长为260 nm，进样量10 μL。

2.1.2 标准曲线绘制 精密称取槐角苷对照品 11.4 mg，置于100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，定容，摇匀，作为槐角苷标准品贮备液。再分别准确量取1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL标准品贮备液，分别用甲醇定容至10 mL，照“ 2.1.1”项下色谱条件进行测定，以峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)，得到标准曲线方程为：y=5E+07x+38 754，R2=0.999 6，槐角苷在11.1～55.6 μg /mL 浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.3 供试品溶液制备 取适量槐角，粉碎过I号筛，准确称取20 g槐角药粉，按不同提取条件进行提取，过滤，精确吸取0.5 mL滤液至100 mL容量瓶中，用相应醇浓度的提取液定容，摇匀，经0.45 μm 滤膜过滤，按“2.1.1”项下色谱条件进样检测。

2.1.4 精密度试验 取对照品溶液适量，按上述色谱条件连续进样5次，每次10 μL，得到的峰面积分别为242940、243936、244788、244186、244143，RSD为0.28 %(n=5)，表明仪器精密度良好。

2.1.5槐角苷得率和固形物纯度的计算 按“2.1.3”项下得出的进样浓度C，槐角苷的得率=(C×V)/M×100%，C(mg/mL)为提取液中槐角苷浓度，V(mL)为提取液体积，M(g)为提取所用槐角药粉的质量。固形物纯度=A/B×100%，A为固形物中所含槐角苷的质量，B为固形物总质量。

2.2 超声提取工艺研究

2.2.1 超声提取单因素试验 (1)乙醇浓度：准确称取4份槐角粉末，每份约 20 g，液固比为8∶ 1 mL /g，超声功率为80%(640 W)，超声提取30 min，提取液醇浓度分别为 60%、70%、80%、90%，按 “2.1.5”项下条件得出槐角苷的得率。结果如图1(A)，槐角苷得率随溶剂量的增加而增加，当乙醇浓度为80%时，槐角苷得率达到最大。

(2)提取时间：准确称取4份槐角粉末，每份约 20 g，提取时间分别设定为 20、30、40、50 min，其他处理同“(1)乙醇浓度”。图 1(B) 为提取时间对槐角苷得率的影响结果，槐角苷得率40 min后达到最大。

(3)提取液固比：准确称取4份槐角粉末，每份约 20 g，提取液固比分别设定为 4∶1、6∶1、8∶1、10∶1 mL/g，其他处理同“(1)乙醇浓度”。图 1(C) 显示了不同超声提取液固比对槐角苷得率的影响结果，当液固比8∶1时，槐角苷得率达到最大。

(4)提取温度：准确称取4份槐角粉末，每份约 20 g，提取温度分别设定为0～10、10～20、20～30、30～40℃，其他处理同“(1)乙醇浓度”。图 1(D) 显示了不同提取温度对槐角苷得率的影响结果，随着提取温度上升，槐角苷得率增大。

(5)提取次数：提取次数考察结果见表1，提取两次以后槐角苷提取率差别不大，考虑提取成本，确定超声提取次数为2次。

表1 超声提取次数对提取率的影响

2.2.2 超声提取正交试验 根据单因素考察结果，设计了4因素3水平的正交试验来优化最佳工艺参数，超声正交试验因素水平见表2，以槐角苷得率为指标，探索不同因素影响槐角苷得率的主次顺序以及最佳提取工艺参数。

超声提取正交试验结果和方差分析见表3和表4。综合表3的极差及表4的方差分析可知，影响超声提取槐角苷得率和纯度的主次因素为：A(料液比)>B(超声时间)>D(乙醇浓度)>C(提取温度)，乙醇浓度具有显著影响。综合直观分析和方差分析可以确定槐角苷超声提取的最佳工艺条件为A2B1C1D3，即料液比8∶1 mL/g，提取时间为30 min，提取温度10～20 ℃，乙醇浓度80%。

图1 超声提取乙醇浓度(A)、提取时间(B)、液固比(C)、提取温度(D)对槐角苷得率的影响

表2 超声正交试验因素水平

表3 超声提取正交试验结果

表 4 超声提取方差分析

2.2.3 验证试验 根据“ 2.2.2”项得出的最佳工艺条件提取，验证3次试验的槐角苷得率分别为：5.27%、5.11%、5.22 %，纯度分别为：4.9%、4.9%、4.8%，相对偏差分别为：RSD=1.6%、RSD=1.2%，说明试验结果可靠，工艺稳定、重复性好。

3 讨论

考虑到槐角苷不溶于水，微溶于乙醇、甲醇，甲醇有毒，考虑工业化生产，因此选择提取溶剂为乙醇，预实验还考察了相同条件下的回流提取法，其操作复杂，槐角苷提取率、得率均明显低于超声提取法，且高温提取易提出杂质，也不利于后续槐角苷的分离纯化。

超声提取为一种先进的提取方法，具有无需高温、操作简单、提取率高、适用性广、耗能少、工艺成本低等特点，本研究确定超声提取法提取槐角苷的最佳参数条件为：料液比8∶1 mL/g、提取时间为30 min、提取温度10～20 ℃、乙醇浓度80%，提取2次，在该工艺条件下槐角苷得率为5.2%，提取率可达到95%以上。该方法具有操作简单、稳定性好、生产成本低等优点，为槐角中槐角苷的提取工艺改良提供了理论参考。