石斛合剂对2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝小鼠mTOR-TFEB-NF-κB的调控作用

陈佳敏，刘 欣，邹玉卿，郑剑萍，庄舒婷，杨晓雯，施 红，2*

(1.福建中医药大学，福建 福州 350122；2.福建中医药大学附属第三人民医院，福建 福州 350000)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)合并非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)是临床常见病，最近的一项Meta分析显示，在T2DM患者中，NASH的患病率高达37.3%[1]。近年来，中医药在T2DM合并NASH的治疗中起着越来越重要的作用，经过多批次基础研究证实，石斛合剂(SHHJ)具有降血糖血脂、促胰岛细胞增生、抑制炎症等功效[2-4]。本研究利用db/db转基因糖尿病小鼠建立T2DM合并NASH模型，探究石斛合剂对T2DM合并NASH模型小鼠mTOR-TFEB-NF-κB通路的调控作用，以期为临床防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄db/db雄性小鼠共40只，8周龄db/m雄性小鼠共10只，SPF级，由南京君科生物工程有限公司提供。动物独立饲养，室温维持在20～22 ℃，相对湿度60%～65%，12 h/12 h昼夜交替光照，适应性饲养1周。db/db小鼠予低蛋氨酸低胆碱(methionine and choline deficient diet，MCD)(MCD可促进诱发脂肪肝向NASH和纤维化发展)饲料喂养4周，制备T2DM合并NASH模型。本研究动物实验得到福建中医药大学伦理委员会批准。

1.2 药物与试剂

石斛合剂方：石斛12 g，黄芪18 g，知母12 g，丹参15 g，葛根15 g，五味子10 g，生地黄15 g，黄连6 g，郁金12 g，大黄6 g，栀子10 g，鸡内金15 g，僵蚕6 g，地龙6 g，由福建福州闽侯致诚药店提供。低蛋氨酸低胆碱饲料(氨基酸预混料，蔗糖，淀粉，玉米油，纤维素，维生素，矿物质，碳酸氢钠，抗氧化剂TBHQ)购于南通特洛菲饲料科技有限公司。TFEB抗体(Thermo Fisher公司，货号PA5-96632)；β-Actin抗体(Proteintech公司，货号BA2350)；HRP-羊抗鼠IgG(Proteintech公司，货号BA1050)；HRP-羊抗兔IgG(Proteintech公司，货号BA1055)；NF-κB抗体(Abcam 公司，货号ab16502)；mTOR抗体(Abcam公司，货号ab2732)；IL-18抗体(Abcam公司，货号ab191860)；IL-1β抗体(Abcam公司，货号ab9722)；TNF-α抗体(Abcam公司，货号ab205587)；伊红染色液(北京索莱宝科技有限公司，货号：G1100-500 mL)；苏木素染色液(北京索莱宝科技有限公司，货号：G4530-500 mL)；Masson三色染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号1340)。

1.3 仪器

摇床(海门麒麟医用仪器厂，型号：TS-1)；电子天平(上海精科天平公司，型号：JA3003)；组织研磨仪(凯航仪器公司，型号：jj-2)；高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司，型号：5417R)；石蜡包埋机(孝感亚光医用公司，型号：YB-7LF)；石蜡切片机(德国LEICA公司，型号：RM2235)；电泳仪(美国Bio-Rad公司，型号：1645050)；电泳槽(美国Bio-Rad公司，型号：165-8001)；化学发光成像仪(美国Bio-Rad公司，型号：Universal Hood Ⅱ)；光学显微镜(日本尼康公司，型号：ECLIPSE 511)。

1.4 动物分组

选取db/m雄性小鼠10只作为正常组，将低蛋氨酸低胆碱饲料喂养4周后的db/db小鼠随机分为4组：模型组、石斛合剂低剂量组、石斛合剂中剂量组、石斛合剂高剂量组，每组均为10只小鼠。各给药组的给药量按照大鼠与人体表面积系数进行换算，正常组和模型组则给予等体积的蒸馏水灌胃。1次/d，连续灌胃4周，均以普通饲料喂养小鼠。

1.5 检测方法

1.5.1 HE、Masson法检测db/db小鼠肝组织 取小鼠肝脏组织制作石蜡切片，小鼠肝脏组织以4%中性多聚甲醛溶液固定、脱水，置于二甲苯中透明，将透明的组织包埋凝固，然后修块、切片、烤片，然后放入二甲苯中脱蜡，再依次放入100%乙醇I、100%乙醇II、95%乙醇I、95%乙醇II、80%乙醇、75%乙醇、70%乙醇中各5 min后，最后放入蒸馏水5 min进行水合。HE：切片用苏木素染色6 min后流水返蓝10 min，1%盐酸酒精分色后再流水返蓝10 min，而后伊红染色6 s，脱水封片，在显微镜下观察。Masson：切片用Weigert铁苏木素染色液染色8 min，酸性乙醇分化液分化10 s，蓝化液返蓝4 min，蒸馏水洗1 min，丽春红品红染色8 min，弱酸工作液洗1 min，磷钼酸溶液洗2 min，弱酸工作液洗1 min，苯胺蓝染色2 min，弱酸工作液洗1 min后，脱水封片，在显微镜下观察。

1.5.2 Western blot法检测小鼠肝脏mTOR、TFEB、NF-κB、IL-18、IL-1β、TNF-α蛋白的表达 肝组织研磨后加入裂解液，4 ℃，12 000 r/min离心15 min后，取部分样品进行蛋白浓度测定，剩下样品加入5×SDS-PAGE loading buffer，用移液枪吹打充分混匀后，在沸水中煮10 min变性。配胶，上样至10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压20 V/10 min、80 V/30 min、120 V/60 min，使蛋白跑到胶底部，按照蛋白分子量大小切下所需胶块，转膜到PVDF膜上后，室温封闭2 h，与特异性抗体在4 ℃孵育过夜，用TBST洗膜后再将条带放于二抗中，摇床上孵育1 h，再次洗膜后用ECL发光液进行显影，用Image Lab软件分析蛋白条带的灰度值。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 石斛合剂对各组小鼠肝组织形态的影响

经肉眼观察，正常组小鼠解剖后的肝脏包膜光滑、色泽红润、边缘锐利、表面光滑(图1A)。模型组小鼠解剖后的肝脏欠光泽，肝表面呈现明显的弥散性粗颗粒状，边缘钝化。石斛合剂各组肝脏表面有细小颗粒表现，较模型组有不同程度的改善。

经HE、Masson染色后(图1B、图1C)，正常组小鼠肝细胞形态完整、排列有序，以中央静脉为中心向周围放射状分布，未见明显脂肪空泡。模型组小鼠肝小叶结构严重破坏，可见大量脂肪空泡聚集，肝细胞排列错乱，肝细胞明显变性，出现碎屑样坏死，炎细胞浸润，肝组织汇管区及中央静脉周围有较多纤维组织增生和桥接式肝纤维化，部分出现中央静脉萎缩或消失。石斛合剂各组小鼠肝细胞排列不整齐，可见脂肪空泡聚集，有不同程度的炎性细胞浸润及肝细胞坏死，汇管区和中央静脉周围纤维组织增生，但较模型组均有减轻。

2.2 石斛合剂对各组小鼠肝脏相关蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组小鼠肝脏mTOR、NF-κB、IL-18、IL-1β、TNF-α水平明显提高(P<0.05)，TFEB明显降低(P<0.05)；与模型组比较，石斛合剂治疗组小鼠肝脏mTOR、NF-κB、IL-18、IL-1β、TNF-α水平明显降低(P<0.05)，TFEB明显升高(P<0.05)；其中石斛合剂中剂量组提高最为明显，其次为高剂量组。见图2、图3。

注：(A)各组代表性肝组织外观；(B)肝组织HE染色(×200)；(C)肝组织Masson染色(×200)。

注：低、中、高剂量组分别为石斛合剂低、中、高剂量组。

注：a：与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；b：与正常对照组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3 讨论

糖尿病属于中医“消渴”范畴，病机以阴虚或气虚为本、痰浊血瘀为标，多虚实夹杂。虚火熏灼成瘀，而成内热瘀毒，毒聚五脏，五脏之毒以肝肾最为严重，因而T2DM合并NASH的重要病因是“热、瘀、浊毒”，可以通过清热、活血、祛浊毒等法进行防治。中药复方可在多系统、多层次、多靶点发挥整体作用，更加契合T2DM合并NASH的病因病机。石斛合剂(SHHJ)可以滋阴益气清热、活血化瘀、祛浊解毒，本研究前期经过多批次基础研究证实，SHHJ具有降血糖血脂、促胰岛细胞增生、抑制炎症等功效，可以改善大鼠的肝功能，重塑肝脏正常形态结构[5]，减少SD大鼠炎症因子表达，增加TFEB表达[4]。

mTOR是雷帕霉素的靶分子，可在细胞和整体水平上调节生理稳态，其介导的磷酸化可负调节TFEB核易位和活性[6]。另外，研究显示TFEB作为自噬和溶酶体功能的主要调节剂，可能是T2DM引起糖毒性反应的关键因素[7]。TFEB可通过有效调节脂质稳态、组织代谢以及炎症反应，而成为治疗T2DM合并NASH的靶标[8]。NF-κB介导的炎症途径是经典的信号传导级联，可调控多种细胞促炎基因，同时在胰岛素抵抗的肝脏和脂肪组织中大量表达[9]。有研究表明，在感染致病菌或脂多糖刺激的小鼠巨噬细胞中，TFEB可直接调节TNF-α、IL-1β、IL-18等的表达[10]，同时TFEB在糖尿病小鼠中可通过抑制IKK活性并增加IκB水平，从而抑制NF-κB的活性。NF-κB通路部分被阻断时，mTOR的活性降低[11]，而TFEB的过表达则可下调NF-κB 的表达，即mTOR-TFEB途径可抑制NF-κB介导的炎症反应[12]。

本研究结果显示，经石斛合剂治疗后，小鼠肝脏组织结构均较模型组有所改善，同时可以降低小鼠肝脏中mTOR、NF-κB、IL-18、IL-6、TNF-α的水平，增加TFEB表达，表明石斛合剂可能通过调节mTOR-TFEB-NF-κB通路来抑制T2DM合并NASH的炎症。不过本研究尚未对其通路所有蛋白进行检测，缺少小鼠血液肝脏纤维化指标的检测，有待进一步研究。