复方天麻首乌片中2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量测定方法的建立

张钰祺，易徐航，杨恢检，熊毓，陈雅静，周璇

萍乡市食品药品检验所，江西 萍乡 337000

复方天麻首乌片为萍乡市中医院的医院制剂，由制何首乌、天麻、泽泻、山楂4 味中药组成，具有养血息风，滋补肝肾之功效，主治肝肾阴虚所致的头痛、头晕目眩、口苦咽干、腰酸乏力、脱发、白发及有上述症状的早期高血压，脑动脉硬化，脂溢性脱发，血管神经性头痛等。何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorumThunb.的干燥块根。何首乌属于典型的“生熟异治”中药品种，其炮制品种制何首乌具有强筋骨、补肝肾、乌须发、益精血、化浊降脂等功效，常用于须发早白、血虚萎黄、腰膝酸软、眩晕耳鸣、高脂血症等［1］。何首乌中化学成分主要为二苯乙烯苷类，其中主要的药效成分为2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷［2-5］。研究表明，2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷有降低总胆固醇，降血脂作用［6-7］。何首乌的炮制方法历史上记载有很多，比如蒸制、黑豆制以及传统的“九蒸九晒”等方式［8-9］，不同的炮制方法对何首乌的化学成分和内在品质会产生不同的影响［10］。制何首乌作为复方天麻首乌片中重要的君药成分，其品质的优劣将直接影响到制剂的临床疗效。因此，为更好地对复方天麻首乌片中制何首乌进行内在质量控制，保障该制剂的临床疗效，研究以2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷为考察指标，采用HPLC 法建立了复方天麻首乌片中制何首乌的含量测定方法，以期为该制剂的质量控制提供科学参考。

1 材料

1.1 试药

对照品：2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批号PF180629-08，Stanford Analytical Chemicals Inc.，纯度99.48%）；甲醇、乙腈（色谱级，北京百灵威公司）；其余试剂均为分析纯；水为娃哈哈纯净水，复方天麻首乌片均由萍乡市中医院提供。

1.2 仪器

高效液相色谱仪（美国Agilent 公司，型号1200）；万分之一电子分析天平（瑞士Mettler 公司，型号ME-204）；十万分之一天平（德国Satorius 公司，型号CP225D）。

2 方法及结果

2.1 溶液制备

2.1.1对照品储备液的制备取2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加入甲醇稀释成每1 mL 含0.4 mg 的储备溶液。

2.1.2供试品溶液的制备取供试品20 片，除去外层包衣，研细，取适量（约相当于本品6 片），精密称定，置具塞锥形瓶内，精密加入甲醇25 mL，称定重量，加热回流1 h，取出放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3阴性样品溶液的制备取天麻100 g 粉碎成细粉；泽泻 100 g、山楂 300 g 加水煎煮两次，分别为2 h，1 h，滤过，合并滤液，浓缩，使其相对密度为1.16～1.20（60 ℃），加入乙醇使含醇含量达到60%，静置沉淀48 h，取上清液，回收乙醇，滤液浓缩，使其相对密度为1.13～1.18（60 ℃），加入天麻细粉及淀粉适量，混合均匀，制粒干燥，使成100 g，按“2.1.2”项下方法制成阴性样品溶液，依法测定，结果表明：阴性样品的HPLC 图谱中，未出现与对照品保留时间一致的色谱峰，见图1。

2.2 色谱条件

色谱柱为Agilent 5 TC -C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以水-乙腈（81∶19）为流动相，流速为1.0 mL/min，波长320 nm，色谱柱温度为30 ℃，进样量为5 μL，结果显示，对照品与其他组分的色谱峰分离度良好。对照品、样品及阴性样品色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图：A.对照品；B.供试品；C.阴性样品

2.3 方法学考察

2.3.1线性关系考察精密量取上述对照品储备溶液，加甲醇逐级稀释得系列标准溶液，使其含对照品浓度分别为10.64，21.28，42.56，85.12，170.24，340.48 mg/L。按“2.2”项下色谱条件进样，以进样浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得回归方程：Y=16.402 21X-8.838 97，r=0.999 99。结果表明对照品进样浓度在10.64～340.48 mg/L 范围内呈良好线性关系。

2.3.2精密度试验精密吸取对照品溶液（85.12 mg/L）5 μL，按“2.2”项下色谱条件重复进样6 次，记录对照品的峰面积，RSD 为0.12%，结果表明精密度良好。

2.3.3稳定性实验取同一批次（批号：20210303）供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12 h 精密吸取5 μL 进样，按“2.2”项下色谱条件，测定2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的峰面积，RSD 为0.78%。表明在室温下供试品溶液12 h 内稳定。

2.3.4重复性试验取同一批次（批号：20210303）样品六份，按“2.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行分析，计算2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量（μg/g）。结果RSD 为1.30%，表明该方法重复性良好。

2.3.5加样回收率试验取已知含量（456.7 μg/g；批号：20210303）的复方天麻首乌片样品，研细，取约相当于本品3 片，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入适量对照品储备液，按“2.1.2”项下方法制备，按“2.2”项下色谱条件进样，测定加样回收率（n=6），结果表明2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的平均回收率为95.15%（RSD%=2.42），结果见表1。2.3.6 耐用性试验 取同一批次（批号：20210303）样品，按“2.1.2”项下方法制备，分别选择Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Sepax Amethyst C18-H（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Welch Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3 种品牌的色谱柱，按“2.2”项下色谱条件测定，结果无明显差别。

表1 回收率试验结果

2.4 样品测定

取不同批号复方天麻首乌片样品，按“2.1.2”项下供试品溶液的制备项下制备供试液。按“2.2”项下色谱条件进样和分析，结果见表2。

表2 复方天麻首乌片样品中2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量（n=3，μg/g）

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

采用DAD 检测器对2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品在190～400 nm 波长范围内扫描，其最大吸收波长为320 nm，因此选择320 nm 作为检测波长。流动相选择中［11］，通过对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸进行测定，结果表明乙腈-水（19∶81）条件下分离效果最好，峰形最佳，故选择乙腈-水（19∶81）为流动相。

3.2 提取方法及时间的考察

提取条件采用超声提取法分别考察了甲醇、50%甲醇、稀乙醇三种提取溶剂，结果表明甲醇提取效率最高［11］。在此基础上，分别考察了水浴加热回流和超声两种方式，结果显示水浴加热回流提取效率更高，故选用水浴加热回流方式。同时对甲醇溶液用量10 mL、25 mL、50 mL 以及加热回流时间30 min、1 h、1.5 h 进行考察，最后确定采用甲醇25 mL 加热回流提取1 h 为宜。

3.3 小结

本研究建立了复方天麻首乌片中2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量测定方法，经方法学验证，该方法准确、快速，操作简便，专属性强，重现性好，从5 批复方天麻首乌片样品中制何首乌的含量测定结果来看，2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量为366.7～856.7 μg/g，可用于复方天麻首乌片的质量评价。