山蜡梅叶提取物的抗炎镇痛药效学研究

万春云，张俊明，雷旭华，朱良辉，李玉云

1.江西省医疗器械检测中心，江西 南昌 330000；2.江西佑美制药有限公司，江西 上饶 333200

山蜡梅Chimonanthun nitensOliv.为我国特有的蜡梅科蜡梅属植物，收载于《中国药典》（1977 年版），主要分布于江西、安徽等地。山蜡梅药用部位为其干燥叶，其中含有丰富的挥发油、总黄酮、生物碱、香豆素等成分，可以泡茶饮用，民间常用于治疗感冒咳嗽。药理研究表明，山蜡梅叶具有清凉消暑、降脂降压的作用［1］。同时有研究表明，山蜡梅叶提取物在镇咳、祛痰、镇痛以及预防心脑血管疾病方面均有一定的药理作用，且能明显改善由感冒等引起的一系列临床症状［2］，山蜡梅叶挥发油和浓缩水提液对金黄色葡萄球菌和流感病毒有较强的抑制作用［3］，山蜡梅感冒茶能显著降低由醋酸引起的腹腔毛细血管的通透性、抑制蛋清所致大鼠脚肿，有较强的炎症抑制作用［4］。然而山蜡梅叶发挥抗炎镇痛活性的有效部位以及物质基础尚不清楚。本实验参照2015 年版《中国药典》四部中挥发油测定法（甲法），蒸馏提取挥发油［5］，药渣水煎醇沉后采用大孔吸附树脂分离纯化制备总黄酮，分别对30%乙醇和70%乙醇两个提取部位的抗炎、镇痛活性进行考察，以期初步筛选山蜡梅叶抗炎镇痛的有效部位，为明确其物质基础提供依据。

1 材料与仪器

1.1 药材

山蜡梅叶药材由江西佑美制药有限公司提供，由朱良辉研究员鉴定为蜡梅科蜡梅属山蜡梅Chimonanthun nitensOliv.的干燥叶。

1.2 动物

SPF 级ICR 小鼠120 只，体质量范围18～22 g，动物合格证NO.43004700042165、NO.43004700049075，生产许可证号：SCXK（湘）2016-0002，来源：湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

1.3 仪器

钻石牌秒表（上海秒表厂）；德国sartorius ME超微量电子天平；德国sartorius BS224S 电子天平；打孔器（孔径8 mm，光大试验仪器厂）；UV2600紫外可见分光光度计（日本岛津有限公司）。

1.4 试药与试剂

阿司匹林肠溶片（拜耳医药保健有限公司，批号BJ38164，规格：100 mg）；布洛芬缓释片（惠州大亚制药股份有限公司，批号171104，规格：0.3 g）；二甲苯（上海化学试剂有限公司，批号1408242）；芦丁标准品（中国食品药品检定研究院，批号0080-9705）。其余试剂均为市售分析纯。

2 方法与结果

2.1 挥发油的提取

取山蜡梅叶2 kg，置提取罐中，加14 倍量水，提取挥发油5 h 后收集挥发油，另器保存。挥发油提取率为2.28%。

2.2 总黄酮的提取

2.2.1总黄酮含量测定方法以芦丁标准品作为对照，采用紫外分光光度法［NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色］在496 nm 处测定吸光度。以芦丁浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制回归曲线，得回归方程为：Y=10.298 83X+0.002 05，r=0.999 2，表明总黄酮含量（以芦丁计）在0.010 0～0.050 0 mg/mL范围内与吸光度A 呈现良好的线性关系。

2.2.2总黄酮类成分的分离和富集取山蜡梅叶提取挥发油后的药渣再加12 倍水煎煮提取1.5 h，滤过，滤液与挥发油提取后的水液合并，浓缩成清膏。放冷，加入等量乙醇，搅匀，静置24 h，滤过，取水提醇沉浸膏，稀释至药材∶药液=1∶1，加相同体积的乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯液无色，回收乙酸乙酯，残渣加水溶解，以药材∶大孔树脂1∶10 的比例上大孔树脂柱，分别用水，30%乙醇，50%乙醇，70%乙醇，95%乙醇洗脱，通过多次重复上述实验，将各洗脱液真空干燥，得干浸膏，分别取适量干浸膏，按上述山蜡梅叶中总黄酮的含量测定方法测定其中黄酮的含量，测定结果见表1。

表1 不同洗脱部位中总黄酮的含量

经过多次重复试验，对山蜡梅叶水提醇沉液中的黄酮类成分进行富集，总黄酮含量较高的两个部位均为30%乙醇和70%乙醇两个部位，故我们将30%乙醇和70%乙醇合并，作为总黄酮提取部位。

2.3 山蜡梅叶中不同提取物对小鼠痛觉潜伏期的影响

取合格试验小鼠60 只，按体质量随机分为对照组、总黄酮5 g/kg（低剂量组）及10 g/kg（高剂量组）、挥发油5 g/kg（低剂量组）及10 g/kg（高剂量组）和布洛芬缓释片0.1 g/kg 剂量组，对照组给予动物饮用水，给药组按相应组别给予不同的药物，均20 mL/kg，1 次/d，连续给药5 次，于末次给药后1 h、2 h 将小鼠尾巴浸于水面以下3 cm，水温（52.0±0.5）℃，小鼠受到热刺激尾巴甩出水面，尾巴甩出水面的时间被记录为疼痛的阈值，为了防止热水对小鼠组织造成伤害，截止时间为10 s。

2.4 山蜡梅叶中不同提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

取合格试验小鼠60 只，按体质量随机分为对照组、总黄酮低剂量组及高剂量组、挥发油低剂量组及高剂量组和阿司匹林肠溶片0.25 mg/kg 剂量组，对照组给予动物饮用水，给药组按相应组别给予不同的药物，均给予20 mL/kg，1 次/d，连续给药5 次，末次给药1 h 后，将小鼠右耳涂抹二甲苯溶液20 μL，均匀涂布于各鼠右耳上、下两面，左耳不涂作对照，30 min 后处死，用打孔器于左右耳对称部位打下耳片，用电子天平称取各鼠耳质量，并计算鼠耳肿胀率。

2.5 统计学方法

2.6 结果

2.6.1山蜡梅叶中不同提取物对小鼠痛觉潜伏期的影响试验在给药后1 h、2 h，总黄酮高剂量组、挥发油低剂量组及高剂量组小鼠痛觉潜伏期明显增加，与对照组比较均差异有统计学意义（均P<0.05），结果见表2。

表2 山蜡梅叶不同提取物对小鼠痛觉潜伏期的影响试验结果

2.6.2山蜡梅叶中不同提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀影响的试验结果除挥发油高剂量组外，其余各组对二甲苯致小鼠耳肿胀均有抑制作用，其中总黄酮高剂量组、挥发油低剂量组具有明显的抑制作用，与对照组比较，均差异有统计学意义（均P<0.05），结果见表3。

表3 山蜡梅叶不同提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响试验结果

3 讨论

山蜡梅叶中化学成分丰富，活性成分众多，主要含有总黄酮、挥发油、生物碱类等成分［6-9］。国家医药管理局中草药情报中心站编著的《植物药有效成分手册》一书报道，以静脉注射的方式将山蜡梅碱注射到狗和猫的体内，发现其对麻醉猫、狗的心脏有抑制作用，血压下降约40%［10］；2018 年袁青青等研究发现山蜡梅叶挥发油具有良好的镇咳、平喘、祛痰、抗炎及免疫调节作用［11］，本实验主要从镇痛、抗炎两方面开展山蜡梅叶药效学研究，以研究其抗炎镇痛作用的有效部位。山蜡梅叶尚未收录至现行药典，仅收录于地方标准，《江西省中药材标准（2014 年）》质量控制仅局限于性状、鉴别、浸出物等［12］，作者前期对总黄酮含量测定方法进行研究，参考2015 年版《中国药典》一部“槐米”项下总黄酮含量方法［13］和文献方法［14］，即吸取供试品1 mL，置10 mL 量瓶中，加入甲醇4 mL，再加入5%亚硝酸钠0.3 mL，放置6 min 后，再加入10%硝酸铝0.3 mL，放置6 min，再加入4%氢氧化钠4 mL，加水定容至刻度，摇匀，放置15 min 后，即得。实验发现，采用氯化铝显色法显色后吸光度衰减时间很短，而硝酸铝显色法则相对稳定性较好，故选择采用硝酸铝显色法。抗炎镇痛实验研究结果可以看出，山蜡梅叶总黄酮高剂量组、挥发油组高剂量组在末次给药后1 h、2 h 小鼠痛觉潜伏期明显增加，与对照组比较差异有统计学意义。山蜡梅叶挥发油和总黄酮对二甲苯致小鼠耳郭肿胀均有一定作用，其中总黄酮高剂量组、挥发油低剂量组具有明显的抑制作用，与对照组比较，差异有统计学意义，需要特别指出的是，实验结果表明，低剂量挥发油影响炎症反应并发挥抗炎作用，但高剂量挥发油具有刺激性作用，其机制可能与前列腺素、促炎细胞因子、一氧化氮以及组胺的参与有关，需要进一步的研究来阐明这一过程。综上所述，挥发油总黄酮类化合物是山蜡梅叶抗炎镇痛作用的主要药效部位。此结论为山蜡梅叶抗炎镇痛的药理作用的研究提供了一定的依据，但其作用机制还有待进一步研究。