酒赤芍的质量标准研究

占丽琴，方磊，罗艳，孙辉，丁野

湖南省药品检验检测研究院,湖南省药品质量评价工程技术研究中心，湖南 长沙 410001

酒赤芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactifloraPall.或川赤芍Paeonia veitchiiLynch 的干燥根的炮制加工品，用于治疗热入营血、温热发斑、吐血、目赤、经闭痛经［1］。现代研究主要针对化学成分及药理作用，不能全面反映药材整体质量［2-5］。因此，本研究进行薄层色谱、水分、总灰分、浸出物、含量测定及指纹图谱研究，为其进一步开发利用提供参考。

1 材料

岛津LC20-AT 高效液相色谱仪（检测器DAD）；色谱柱 Capcell MG C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；色谱工作站Empower、Lecia DM2500。芍药苷（批号110736-201842，纯度：9.74%）对照品；没食子酸（批号110831-201605，纯度：90.8%）对照品；赤芍（批号121093-201804，纯度：97.4%）对照药材均购自中国食品药品检定研究院。实验用样品15 批次（批号19062619、19100723-1、19100723-2、19100723-3、Y20191001、Y20191002、Y20191003、201910007、201910008、201910009、16032302、2019060051、2019102101、2019102102、2019102103）来自不同的生产单位及使用单位，产地为安徽、四川、内蒙古自治区，经湖南省药品检验研究院中药所丁野主任中药师鉴定为酒赤芍，部分样品见图1。

图1 酒赤芍部分样品性状图

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

参照《中国药典》2015 年版一部赤芍项下薄层鉴别方法，研究拟定展开剂为“二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）”，并增加赤芍对照药材做对照［6］，结果在与对照品、对照药材溶液的斑点相应位置检出供试品斑点。结果见图2。

图2 酒赤芍薄层色谱图

2.2 检查

水分、总灰分、水溶性浸出物均按《中国药典》2015 年版相关规定测定，结果如表1。

表1 酒赤芍水分、总灰分、浸出物测定表（%）

2.3 含量测定

2.3.1溶液的制备对照品溶液：精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇溶解，摇匀，得对照品储备液（1.050 8 mg/mL）。精密吸取对照品储备液适量，加甲醇稀释成对照品溶液。

供试品溶液：取本品粗粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25.0 mL，称定重量，浸泡4 h，超声（300 W，30 kHz）20 min，放冷，用甲醇补重，混匀，即得。

2.3.2色谱条件及系统适应性色谱柱：Capcell MG C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：甲醇-0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液（30∶70）；流速：1.0 mL/min；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃。理论板数按芍药苷峰计，不低于3 000。见图3，图4。

图3 芍药苷对照品色谱图

图4 酒赤芍样品色谱图

2.3.3线性关系考察精密吸取浓度为0.042 0、0.105 1、0.420 3 mg/mL 的对照品溶液10 μL，1.050 8 mg/mL的对照品溶液10 μL 和20 μL，按“2.3.2”法测定，以峰面积及进样量（ng）分别为纵坐标、横坐标，绘制标准曲线。其回归方程为：y=1 402.5x-106 296，r=1。结果表明芍药苷在420.3～21 015.0 ng 范围内线性关系良好。

2.3.4精密度、重复性、稳定性试验取酒赤芍供试品溶液（批号2019102101），按“2.3.2”法测定，记录色谱峰面积，计算RSD（n=6）分别为0.45%、0.55%、0.30%，表明仪器精密度、重复性及24 h稳定性良好。

2.3.5加样回收率试验取同一酒赤芍供试品溶液（批号2019102101）约0.25 g（6 份），精密称定，置锥形瓶中，精密加入适量的芍药苷，按“2.3.1”制备供试品溶液，测定，结果平均加样回收率为100.3%，RSD（n=6）为1.2%。见表2。

表2 加样回收率试验结果

2.4 指纹图谱

2.4.1溶液的制备 对照品溶液的制备：分别精密称取芍药苷、没食子酸对照品适量，置于25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得对照品溶液。供试品溶液的制备：同“2.3.1”中供试品溶液的制备。

2.4.2色谱条件梯度洗脱（0～60 min，5%～45% B；60～61 min，45%～5% B；61～70 min，5% B），其他色谱条件同“2.3.2”测定，酒赤芍样品的色谱峰分离较好。见图5。

图5 对照品（A、B）及酒赤芍样品（C）的色谱图

2.3.6样品测定结果对收集的15 批酒赤芍进行了含量测定，结果见表3。

表3 样品含量测定结果（%）

2.4.3精密度、重复性、稳定性试验取酒赤芍供试品（批号2019102101）适量，按照“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.2”项下色谱条件进样，以5 号芍药苷色谱峰为参照峰（S），计算得到各共有峰的相对峰面积RSD 范围分别为0.24%～2.41%、0.01%～0.04%、0.01%～0.09%，表明仪器精密度、重复性、24 h 稳定性良好。

2.4.4指纹图谱的建立将15 批酒赤芍样品色谱图导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2009 年版），以S1 号样品色谱图为参照图谱，平均值法生成对照指纹图谱R，时间窗宽度为0.1，进行多点校正和色谱峰匹配，生成共有峰模式，进行相似度评价。酒赤芍样品HPLC 叠加图谱及对照图谱见图6，相似度评价结果见表4。共确定9 个共有峰，通过与对照品比对，指认其中2个成分。其中5 号芍药苷峰的紫外吸收较强，峰面积较高，保留时间合适，设为参照峰。计算得到各共有峰的相对保留时间的RSD 为0.02%～0.05%，相对峰面积RSD 为29.96%～139.55%，说明不同来源样品质量存在差异。15 批酒赤芍样品指纹图谱与对照图谱的相似度为0.875～0.995，表明不同来源酒赤芍质量相对稳定，但个别样品间含量差异较大，这可能与产地、生长年限及炮制工艺等有关。

表4 相似度评价结果

图6 样品HPLC叠加图谱（S1～S15）及对照指纹图谱（R）

2.4.5聚类分析以9 个共有峰的峰面积为变量，导入SPSS 22.0 软件，进行系统聚类分析［7-9］。当分类距离为10 时，不同来源的15 批次酒赤芍样品可分为4 大类，S1、S2、S3、S4 号样品聚为一类，S13、S14、S15 号样品聚为一类，S11 号单独一类，其余样品聚为一类，见图7。

图7 不同来源的15批次酒赤芍样品聚类分析图

2.4.6主成分分析采用SPSS 22.0 软件，以15 批酒赤芍样品指纹图谱中的9 个共有峰为变量，进行因子分析，Bartlett 球形检验结果Sig.值为0，表明适合做因子分析［10-11］。以特征值大于1 为提取标准，提取得到3 个主成分累计方差贡献率为91.739%，可以代表指纹图谱数据的大部分信息，见表5。

表5 特征值和方差贡献率（%）

由表6 可知，特征峰1、2、3、6 在第1 主成分中有明显正载荷值，特征峰7 号在第2 主成分中有明显正载荷值，特征峰3、4、5、8、9 在第3 主成分中有明显正载荷值，表明酒赤芍的质量是多个成分作用的结果。

表6 初始因子载荷矩阵

由图8 可知，所有样品可分为4 类，与聚类分析结果一致。

图8 主成分得分图

3 讨论

3.1 试验条件考察

在指纹图谱试验中考察了水、甲醇、50%甲醇为提取溶剂，最后显示甲醇提取后成分较多。考察了超声提取、加热提取两种提取方法，结果显示提取成分没有差异，考虑试验经济学最终选取超声提取方法。

3.2 指纹图谱分析

通过上述三种分析方式，对不同来源的酒赤芍样品的9 个共有峰进行分析。通过对照品比对，指认出其中2 个峰为共有峰，分别为没食子酸和芍药苷。在相似度评价中，15批样品相似度为0.875～0.995，表明不同来源酒赤芍的化学成分种类相似，质量相对稳定。聚类分析与主成分分析显示S13、S14、S15与其他样品存在差异，与相似度评价结果一致。

4 结论

本试验对15 批酒赤芍薄层色谱、水分、总灰分、浸出物、含量测定、指纹图谱进行研究，建立方法准确可靠，可用于酒赤芍饮片的质量控制，为酒赤芍的质量评价提供参考。