宏基因组二代测序对重症监护病房内脓毒症患者治疗及预后的影响研究

张 绵，曾 东，郑 华

郑州市第七人民医院，河南 郑州 450000

脓毒症是由于感染导致的全身炎症反应综合征，是宿主对感染的免疫失调反应，脓毒症能够导致患者多器官功能障碍，脓毒症和脓毒症休克是重大的医疗问题，对患者生命安全造成严重威胁，死亡率极高［1］。临床研究发现，在患者确认脓毒症之后越早应用抗菌药物患者获益越大，目前规定在留取微生物标本后，最好1 h 内根据经验性的感染部位启动静脉抗菌药物治疗，并在微生物学确认之后，基于患者的感染细菌、药敏结果、临床症状体征来调整抗菌药物。利用宏基因二代测序技术更优于微生物培养，它能更快速的检测出微生物，包括细菌、病毒、真菌，且阳性率相对较高，因此对于常规培养难以查出病原体的患者进行检测，及早发现目标致病菌，更利于对患者后续调整治疗产生影响［2-3］。随着下一代测序技术的发展，其中的宏基因组具有病原菌检出阳性率高、范围广、检出速度快、甚至耐药基因检查等特点，并且无需培养，鉴别致病菌（尤其是病毒和真菌），在对于重症监护病房中脓毒症患者进行感染源筛查检查、抗感染治疗等方面的指导具有显著优势，但是在当前关于该方面的研究相对较少［4］。本研究对于2019 年10 月—2020 年4 月郑州市第七人民医院重症医学科收治的20例脓毒症患者送检的宏基因组二代测序的资料进行回顾性分析，探讨基于宏基因组二代测序技术在脓毒症患者中的治疗优势和对预后影响的应用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019 年10 月—2020 年4 月郑州市第七人民医院重症医学科收治的20例脓毒症患者作为研究对象，其中男13 例，女7 例，所有患者的诊断与治疗原则符合国际脓毒症诊疗指南的要求和标准。

1.2 方法

收集所有符合入组标准患者的资料，入重症监护病房时的急性生理与慢性健康评分、感染部位、实验室检查如C-反应蛋白、中性粒细胞比例以及血白细胞计数、血总胆红素、降钙素原以及凝血酶原时间，序贯器官衰竭评分、送检前临床生命体征参数，如心率、体温、平均动脉压、机械通气、血管活性药物使用、肾脏替代治疗等，而预后评估指标中包含如重症病房病死率、住院7 d 及28 d 病死率等。在病原学治疗方面，获取患者宏基因组二代测序报告，将宏基因组二代测序前后的微生物学报告送检，如病毒定量聚合酶链式反应、微生物培养等，评估宏基因组二代测序报告和送检前后任意一份微生物学报告的临床一致性，宏基因组二代测序结果往往会是多种病原体，根据检测结果及感染部位等分析判断可能的致病菌。宏基因组二代测序报告和送检前后任一微生物学报告存在重叠致病菌的话，那么则意味着病原体一致。宏基因组二代测序回报之后调整抗感染药物治疗方案，如果临床症状改善则为有效。

1.3 宏基因组二代测序标本和送检流程

送检标本必须要符合华大基因的相关要求，如脑脊液、痰液、血液、腹水以及支气管肺泡灌洗液等。分析样本中的微生物，并与数据库中原来的微生物核酸序列之间进行比较，鉴定微生物。检测过程为：提取核酸、RNA逆转录、构建文库、测序、信息分析与报告解读等。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS 12.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t 检验。计数资料以例数和百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征与预后

送检宏基因组二代测序选取的20例重症监护病房的脓毒症患者，入重症病房前的急性生理与慢性健康评分为（23.00±9.54）分。其中，11例患者可疑多部位感染，其中血流感染是最为常见的感染部位，其次为肺部感染。送检之前，化验感染指标发现，血白细胞计数偏高，降钙素原低水平升高。在20 例患者中，预后方面共有9 例出现死亡，住院28 d死亡10例患者，见表1。

表1 脓毒症患者的临床特征和预后情况

2.2 测序结果及治疗调整

送检22 例基于二代测序的宏基因组样本，其中，血液标本12 例、痰液标本3 例、共有4 例支气管肺泡灌洗液标本、腹水标本1 例、脑脊液标本2 例。22 例标本中，检出阳性为21 例，阳性率95.45%。其中，共有11 例检出病毒，3 例检出革兰氏阳性菌，1 例结核分枝杆菌，6例检出巨细胞病毒，9 例检出革兰氏阴性菌，6 例检出真菌。共有8 例传统微生物学培养报告呈现为阳性，阳性率为36.4%，明显低于二代测序结果。二代测序结果与临床诊断比较，2 例不符，但是比较临床与传统微生物学报告的话，共有7 例符合，要比宏基因组二代测序低。基于二代测序技术的宏基因组结果，来对于14 例患者调整抗菌药物治疗，其中患者临床症状得到改善的共有8例。见表2。

表2 传统微生物学报告和二代测序情况 （例）

3 讨论

脓毒症是临床上急危重症患者出现死亡后果的一项关键因素。患者在患病之后，将会引发全身性炎症反应以及广泛性的组织损伤，机体对感染的免疫反应失调，从而导致患者出现肝肾功能衰竭、呼吸功能衰竭及凝血系统问题等严重的多器官功能障碍，甚至导致患者出现死亡。所以，尽早明确患者的感染部位、感染病原体及疾病的严重程度，并基于此实施针对性的治疗措施，是治疗脓毒症成败的关键所在。当前，对于脓毒症患者的严重程度进行判断和预后预测时，其主要方式还是采取急性生理与慢性健康评分为主［5-6］。

传统的微生物检测主要是通过免疫、生化以及培养等实验方式检测样本中的微生物种类与定量信息，临床上常用的检测方法有PCR扩增法、微生物培养法以及涂片镜检法，而微生物检出率常常会被抗生素治疗所影响，并且所需要的时间较长。提高检测精准度和效率才是病原微生物检测的目标［7］。基于宏基因组二代测序技术中的微生物检测方式，对于宏基因组样本进行完全测序，从而得到宏基因组的核酸序列，并通过生物信息学工具核酸序列数据，并获取微生物基因信息，该方式具有无需培养样本，可以检测未知微生物甚至包括病毒、真菌等，灵敏度非常高等众多优势，完善了传统微生物检测上的不足，为临床诊断及治疗提供了更可靠的决策依据［8］。

临床常用的一种检测方式中，基于已知病原体的特点非常常见。但以二代测序进行宏基因组检测，可以更快得到未知病原体，从而对标本进行测序、分析，能够使临床医师及早根据患者的实际症状、临床表现，快速确定病原体，从而更及时做出治疗的预判。截止目前，临床上已有超过38 000 个细菌基因组和超过5 000 个病原基因组的序列已经被测定，基于二代测序技术的宏基因组技术能够规避细菌培养结果相似而发生的区分困难。所以，在临床医疗中二代测序具有着非常重要的作用。因此，宏基因组二代测序技术由于其自身的众多特点已经成为了诊断疑难危重症感染疾病的关键核心所在。在重症监护病房的脓毒症患者中应用二代测序，协助医生尽快诊断病原学甚至微生物的耐药基因，医师可以更及时、准确的基于此实施针对性的治疗，更利于患者尽早康复［9］。

提高传统病原微生物培养方式，诊断病原学发现，临床最为常见的致病菌为革兰氏阴性菌，其次为革兰氏阳性菌、真菌、厌氧菌以及寄生虫等。但随着二代测序、PCR等不依赖培养的技术和方法的出现，脓毒症病原学构成也发生了一定变化，本研究结果显示，二代测序技术的诊断具有较高的阳性率，在送检前后，病原学培养、病毒定量PCR中，阴性患者12例，仅一次未检出病原体。而本次研究的病毒检出率为55%。其实重症监护病房中，病毒感染十分常见，除了最开始是病毒导致的脓毒症以外，还包括潜伏病毒再激活，并且潜伏病毒再激活的比例和免疫抑制患者之间存在高度相仿。经过专家学者调查研究发现，重症监护病房内，正常免疫功能的患者感染CMV 率达到了27%，再激活率为3l%，如果患者一旦出现CMV 感染、CMV再激活等情况，却并没有对患者实施相应的治疗，将会直接导致患者死亡［10］。

经过调查研究发现，脓毒症指数是由测序序列数计算得出，在脓毒症患者中，其致病菌的脓毒症指数丰度、绝对值均出现显著性增高并且变化情况和临床表现之间存在直接关系，对患者实施治疗，患者的脓毒症指数将会迅速下降。本研究中，脓毒症患者基于宏基因组二代测序技术的结果来调整治疗，其中，首先需要明确致病菌，并基于此目标加强治疗。其次，排除可疑致病菌，同时停用相应的抗感染药物，减少多种抗菌药物的毒副作用及减少重症患者二重感染的风险，减少营养不良的发生［11］。本次研究中，脓毒症患者在经过治疗调整之后，其临床症状得以改善，并且调整有效率相对较高。但是，本次研究仅是通过临床症状改善结果对调整效果进行判断。如果可以对宏基因组二代测序结果进行动态检测的话，可以有更高的依据。本次研究中，所送检的标本中具有非常多的类型，如痰液、血液、腹水、肺泡灌洗液、脑脊液标本等，其中痰液标本、腹水标本中的检出菌种相对较多，在区分致病菌和定植菌方面存在一定难度。所以，血液标本、脑脊液标本以及肺泡灌洗液标本可能是重症病房中脓毒症患者检测的最好选择。但研究发现，血液标本中也会存在非致病微生物序列，尤其是当前根据二代测序结果来判断致病菌和污染菌等，还尚未有清晰明确的研究。所以，在测序结果为依据方面，还需要结合临床实际情况甚至反复多次检测来核实［12］。

在重症监护病房的脓毒症患者中采用宏基因的二代测序技术，依旧还存在一定不足，例如宏基因组二代测序目前的费用相对较高，并且不在医保报销范围，增加了患者的经济负担。而相关研究中，真菌、细菌测序的覆盖率相对较低，药敏处于未知状态，仅能满足种属鉴定需求，但是能够利用耐药基因型的检测适当的弥补，关于药敏方面还要根据主管医师的临床经验来定。

综上所述，在重症监护病房的脓毒症患者中，应用宏基因组二代测序技术能够显著提升病原体检出阳性率，检出时间方面较常规培养方法也更提前，可以更加详细、及时的指导临床医师治疗方案，从而改善重症脓毒症患者的预后，建议在临床推广应用。