原发性胆囊癌中T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1的表达及临床意义

邓颖慧

(首都医科大学石景山教学医院，北京市石景山医院，北京 100043)

原发性胆囊癌是胆道系统中最常见的恶性肿瘤。胆囊癌发病率居消化系统肿瘤的第6位，占胆道肿瘤的80%～95%。因其早期症状不典型，诊断比较困难，多数患者明确诊断时已为中晚期[1]。目前胆囊癌疾病生物学机制尚不明确，缺少特异性标志物[2]。T细胞淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam1)是近年来新发现的一种重要的肿瘤侵袭及转移的相关基因，在乳腺癌、胃癌与肺癌等多种癌组织中呈比较高的表达率[3]。

本实验选取具有详细临床资料和随访结果的52 例原发性胆囊癌及10 例非癌性胆囊疾病的石蜡包埋组织，通过应用免疫组织化学方法检测Tiam1在原发性胆囊癌和非肿瘤性胆囊疾病组织的表达情况，分析Tiam1的表达程度及其与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤侵犯深度、淋巴结转移、淋巴血管侵犯、TNM分期的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源

收集2012年1月—2018年1月经病理证实为原发性胆囊癌的患者石蜡标本52 例，胆囊良性疾病患者石蜡标本10 例，所有标本均为手术后切除标本，并且临床资料完整。所有病例具有详细的临床资料和随访结果，并且术前均未接受放疗和化疗。术后病理切片经过两位病理专家阅片证实。52 例胆囊癌患者中，肿瘤>2.5 cm 24 例(46.15%)，≤2.5 cm 28 例(53.85%)。

1.1.2 病例查询内容

患者住院号、病理号、性别、年龄、肿块大小、浸润深度及淋巴结转移情况、淋巴血管侵犯情况、手术日期、死亡日期及随访日期。

1.1.3 主要实验器材

医用净化工作台：苏州金燕净化设备厂生产。冰冻切片机：德国徕卡公司生产。微波炉：格兰仕公司生产。烤箱(DHG-9053A)：上海一恒科技有限公司生产。光学显微镜(CX51)：日本OLYMPUS公司产品。照相显微镜：日本OLYMPUS公司产品。

1.1.4 主要试剂

免疫组化染色超敏试剂盒(S-P法)：北京中山生物公司。浓缩型兔抗人Tiam1多克隆抗体：Abcam公司。DAB显色试剂盒：北京中杉金桥公司。0.01%枸椽酸盐缓冲液：1 000 mL蒸馏水内加枸椽酸0.4 g，枸椽酸钠3 g。PBS缓冲液(PH=7.4)：1 000 mL蒸馏水内加入Na2HPO4·12H2O 6 g，NaH2PO4·2H2O 0.4 g，氯化钠9 g。

1.2 实验方法

本实验运用免疫组织化学EnVisionTM二步法测定Tiam1表达情况。按照试剂盒操作说明书操作，Tiam1抗体工作浓度为1∶100，具体操作步骤如下。

1.2.1 实验步骤

甲醛固定标本24 h后进行脱水、浸蜡、包埋、制备5 μm厚的石蜡切片，60 ℃烘烤10 min。此过程由哈尔滨医科大学附属第三医院病理科协助完成。石蜡切片二甲苯脱蜡、乙醇水化：将石蜡切片依次浸入二甲苯Ⅰ液2～5 min，浸入二甲苯Ⅱ液2～5 min；浸入无水乙醇中1～2 min，浸入95%乙醇中1～2 min，浸入80%乙醇中2～5 min，浸入70%乙醇中2～5 min；自来水冲洗片刻，蒸馏水冲洗5 min。用PBS缓冲液冲洗2 次，每次5 min，用干纱布吸干PBS液。30%过氧化氢室温孵育10 min，以灭活内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水冲洗3 次。石蜡切片高压抗原修复：将适量的抗原修复液在微波炉中加热煮沸；将切片置于金属架上，放入微波炉中，使切片位于液面以下加热，然后微波解冻15 min，至室温，蒸馏水冲洗后，PBS缓冲液洗涤3 次，每次5 min。每张切片滴加50 μL正常山羊血清封闭液，室温下孵育60 min。PBS洗涤5 min，连续3 次。每张切片滴加50 μL一抗，20～37 ℃条件下孵育1 h，PBS缓冲液洗涤3 次，每次5 min。滴加二抗，20～37 ℃条件下孵育60 min，PBS缓冲液洗涤3 次，每次5 min。滴加S-P免疫复合物(三抗)，20～37 ℃条件下孵育20 min，PBS洗涤3 次，每次5 min。DAB显色：每张切片滴加50 μL新鲜配制的DAB显色剂(取1 mL蒸馏水，加入DAB显色剂盒A，B，C试剂中各1 滴，混匀)，室温显色，一般5～30 min，蒸馏水冲洗。苏木素复染细胞核5 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.2 结果判定方法

免疫组化结果由2名不了解临床资料的高级职称病理科医师共同阅片，Tiam1阳性细胞着色见于细胞质，呈黄褐色。染色结果的判定为高倍镜下每张切片选择10个有代表性的视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，共计数1 000个细胞。Tiam1的表达情况根据染色强度及染色阳性细胞的百分率来计分。

1.2.2.1 染色强度计分标准

0 分：无色；1 分：淡黄色；2 分：棕黄色；3 分：黄褐色。

1.2.2.2 阳性染色细胞百分率计分

0 分：阳性细胞数0；1 分：阳性细胞数0～10%；2 分：阳性细胞数10%～50%；3分：阳性细胞数>50%。

1.2.2.3 分值计算

将两种计分结果相乘得到肿瘤最终得分。肿瘤最终得分>4 分者(即肿瘤10%的细胞染色强度中等或强)被视为Tiam1的阳性表达，≤4 分为阴性。最终结果由两位病理医师使用双盲法分别观察每张切片的情况，并获得一致意见。

1.3 统计学方法

本实验将Tiam1在原发性胆囊癌组织中的表达程度与非肿瘤性胆囊组织不同的生物学特征进行比较，采用χ2检验，不满足χ2检验条件的使用Fisher精确概率检验。所有数据采用SPSS18.0统计软件处理，双侧检验，α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Tiam1在胆囊癌组织和非癌性胆囊组织中的表达

胆囊癌细胞中Tiam1的阳性染色主要集中在细胞质中(见图1)，呈黄褐色颗粒状物质，颜色不一。Tiam1阳性表达44 例(84.61%)。在非癌变的胆囊组织中均未检测到Tiam1免疫反应(见图2)。

Tiam1在胆囊癌组织中呈阳性表达，黄褐色，位于细胞浆 (SP×400)

Tiam1在非癌性胆囊组织中呈阴性表达(SP×400)

2.2 原发性胆囊癌Tiam1的表达与临床特征的关系

2.2.1 原发性胆囊癌Tiam1的表达与性别和年龄的关系

52 例原发性胆囊癌患者中，男性和女性患者Tiam1阳性表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。年龄≥60 岁和年龄<60 岁患者阳性表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

表1 胆囊癌组织中Tiam1的表达与年龄和性别的关系

2.2.2 原发性胆囊癌Tiam1的表达与肿瘤浸润深度和淋巴血管侵犯的关系

52 例原发性胆囊癌组织中，肿瘤浸润至黏膜层、肌肉层、结缔组织和浸出浆膜患者的Tiam1阳性表达率比较，差异有统计学意义(P=0.007)；有淋巴血管侵犯和无淋巴血管侵犯患者的Tiam1阳性表达率比较，差异有统计学意义(P=0.009)(见表2)。

表2 胆囊癌组织中Tiam1的表达与浸润深度和淋巴血管侵犯的关系

2.2.3 原发性胆囊癌Tiam1的表达与肿瘤淋巴结转移和肿瘤分期的关系

52 例原发性胆囊癌患者中，有淋巴结转移和无转移患者的Tiam1阳性表达率比较，差异有统计学意义(P=0.010)。根据2018年美国国立综合癌症网络(NCCN)指南对52 例原发性胆囊癌患者进行分期，其中Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期患者的Tiam1阳性表达率比较，差异有统计学意义(P=0.005)(见表3)。

表3 胆囊癌组织中Tiam1的表达与淋巴结转移及分期的关系

3 讨 论

肿瘤侵袭转移涉及肿瘤细胞恶性增殖、肿瘤组织新生血管形成、肿瘤细胞黏附分泌蛋白降解机制及肿瘤细胞迁移运动、躲避免疫监视等多种过程，是一个非常复杂的生物学现象。研究发现[4]，肿瘤细胞的侵袭、转移能力与其自身的运动能力密切相关。细胞骨架结构特性的不同导致其运动能力的不同，是肿瘤细胞区别于正常细胞以及其他具有不同转移潜力的肿瘤细胞之间的生物遗传素质差异的具体表现。

Tiaml是Habets等[5]于1994年从鼠T淋巴瘤中分离出来的一种肿瘤转移诱导基因，其产物Tiaml蛋白作为一种鸟苷酸转换因子，特异性激活Rac1，并通过Tiaml-Rac信号途径，改变肿瘤细胞的形态和功能。Tiam1蛋白通过与其他蛋白质分子相结合进行亚细胞定位及活性调节[6-7]，参与了细胞骨架重组、形体极化、运动和迁移过程[8-9]，诱导肿瘤细胞的恶性转化，与多种肿瘤的侵袭转移有关[10-11]。近年来越来越多的研究已经证实了Tiam1在肿瘤进展中的作用，在肺癌、结直肠癌、卵巢癌、胃癌等多种肿瘤中都发现Tiam1蛋白的高表达，并且与肿瘤的转移、预后相关[12-13]。

Tiam1能够激活Rac1并诱导细胞膜的细胞骨架介导的细胞形态变化、细胞黏附运动，从而在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥作用。Tiam1作为Ras超家族的分离刺激因子，结构中含有DH(Db1 homology)和PH(Pleckstrin homology)结构区，其DH区能够诱导肿瘤细胞的侵袭和转移。正常表达的Tiam1或只含有DH功能区的蛋白都具有这种诱导肿瘤细胞侵袭和转移的特性。

虽然原发性胆囊癌的总体发病率不是很高，但却是胆道系统恶性肿瘤中最常见的一类。原发性胆囊癌早期缺少特征性症状和体征，这是由于早期胆囊癌病变小、局限，其临床表现及各种检查与胆囊结石雷同或易被结石掩盖。其早期诊断困难，多数患者诊断时即为中晚期，导致胆囊癌患者预后差，生存率低，5 年总生存率仅为5%[14]。因此提高胆囊癌的早期诊断率及寻找更有效的治疗手段一直是人们关注的问题。有学者[15]也对胆囊癌的分子生物学异常进行了广泛而深入的研究，试图寻找胆囊癌的早期诊断分子标志物和潜在的治疗靶点。

本实验采用了免疫组化法检测Tiam1在52 例原发性胆囊癌组织、10 例非肿瘤性胆囊组织中的表达。结果显示原发性胆囊癌组织中Tiam1阳性率为84.61%，非肿瘤性胆囊组织中呈阴性表达。结合临床资料，探讨Tiam1与胆囊癌的临床病理之间关系，证实Tiam1阳性表达的肿瘤患者更易出现肿瘤的淋巴结转移(P=0.010)和淋巴血管侵犯(P=0.009)。52 例原发性胆囊癌患者中，Tiam1表达阳性的淋巴结转移病例为13 例(86.67%)，Tiam1阳性表达但未发生淋巴结转移病例31 例(83.78%)，两者比较差异有统计学意义(P=0.010)。有淋巴血管侵犯的Tiam1阳性表达率为92.31%(12/13)，无淋巴血管侵犯的Tiam1阳性表达率为82.05%(32/39)，两者比较差异有统计学意义(P=0.009)，提示Tiaml蛋白的高表达与胆囊癌的淋巴结转移和淋巴血管侵犯密切相关，说明Tiaml蛋白在胆囊癌的进展过程中发挥重要作用。

本研究中Tiam1阳性表达胆囊癌患者与肿瘤分期、浸润深度及患者生存具有相关性。根据2018年NCCN指南对52 例原发性胆囊癌患者进行分期，其中Ⅰ～Ⅱ期Tiam1阳性表达率为79.41%(27/34)，Ⅲ～Ⅳ期Tiam1阳性表达率为94.44%(17/18)，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示Tiaml蛋白高表达与胆囊癌的恶性程度密切相关。52 例原发性胆囊癌组织中，肿瘤浸润至黏膜的Tiam1阳性表达率为0(0/2)，肌肉层的Tiam1阳性表达率为75.00%(6/8)，结缔组织的Tiam1阳性表达率为90.00%(27/30)，浸出浆膜的Tiam1阳性表达率为91.67%(11/12)，四者比较差异有统计学意义(P=0.007)。Tiam1阳性表达胆囊癌患者与患者年龄、性别、肿瘤大小无关。

研究表明，Tiaml可提示结肠癌[16]、食管癌[17]、胃癌[18]、乳腺癌等多种肿瘤的预后，即Tiaml蛋白高表达患者生存期短、预后差。Li等[19]通过免疫组化染色发现，Tiaml高表达是影响乳腺癌患者不良预后的独立风险因素。本次研究发现Tiaml蛋白高表达与胆囊癌患者的淋巴转移、淋巴血管侵犯、临床分期密切相关，提示Tiaml蛋白高表达的患者预后差、生存时间短(即Tiaml蛋白高表达可成为胆囊癌患者不良预后的一项分子指标)。

综上所述，Tiam1在胆囊癌的转移、侵袭过程中起了一定的作用，对于判断胆囊癌的进展具有一定的价值。