基于网络药理学探讨托法替布联合甲氨蝶呤治疗类风湿关节炎的作用机制

赵妍，赵晶晶，刘爱芬，郭雪梅，康莉，陈兵

（1.天津医科大学第二医院内分泌科，天津 300211；2.天津医科大学第二医院肾内科，天津 300211；3.天津医科大学第二医院麻醉科，天津 300211；4.天津医科大学图书馆，天津 300070；5.天津医科大学第二医院重症医学科，天津 300211）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫疾病。它的病理生理机制主要为关节滑膜内的炎症因子刺激免疫细胞释放大量炎性和细胞因子，导致关节破坏和关节外血管炎等损害[1]。RA 病程长，病死率高，严重影响患者身心健康和生活质量[2-3]。目前，甲氨蝶呤已成为治疗RA 的基础用药，其化学结构与叶酸相似。其通过抑制二氢叶酸还原酶和酰基转移酶的活性，抑制嘌呤和嘧啶核苷酸的合成，抑制淋巴细胞活化，减轻炎症和关节疼痛。但长时间大剂量的应用会增加药物不良反应，限制了其临床的广泛应用[4]。

托法替布是一种小分子Janus 激酶（JAK）抑制剂，实验证实其通过抑制JAK-信号转导与转录激活因子（STAT）信号通路，降低STAT 的磷酸化水平，从而降低下游炎性细胞因子的合成，达到调控炎症的目的[5-7]，从而引起了人们的广泛关注。研究报道，托法替布不但可以明显缓解RA 患者的症状，而且联用甲氨蝶呤可达到更优的治疗效果[8-9]。

目前，托法替布联用甲氨蝶呤治疗RA 的分子机制尚未完全阐明。本文采用网络药理学方法，针对托法替布和甲氨蝶呤的预测药效团、靶蛋白/基因和分子药理机制进行深入探讨，从而确定两者的适应证和不良反应，更好的指导临床实践。

1 材料和方法

1.1 相关数据库和平台 化学模组pubchem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、药效团匹配与潜在识别靶标PharmMapper 在线平台（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）、STRING 平台（https://string-db.org）及网络图像化软件Cytoscape（v 3.7.2）。

1.2 化合物结构的筛选和药效团模型靶点的预测 以“Tofacitinib”和“Methotrexate”为关键词，通过pubchem 数据库获取化合物的活性成分，并下载它们的2D 和3D 结构。PharmMapper 平台上导入化合物的3D 结构文件，得到预测药效团模型的元素（蛋白结构、特征数目、分值、校正分值、靶点基因等）和可能靶蛋白/基因。

1.3 蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建和可视化分析 利用STRING 平台获得靶蛋白/基因之间的关系，构建蛋白质相互作用网络。将托法替布和甲氨蝶呤的靶蛋白/基因导入网络图像化软件Cytoscape（v 3.7.2），其中“节点（node）”代表靶蛋白/基因，“线（edge）”代表靶点之间的关系，对其网络特征进行可视化分析。

1.4 富集通路分析 通过统计R 软件（R x64 3.5.2）对上述靶点进行功能富集分析和信号通路分析。同一种颜色的节点代表同一类型的信号通路，节点的大小代表信号通路的显著程度。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 托法替布和甲氨蝶呤的化合物结构筛选和药效团模型靶点预测 通过pubchem 平台分析得到托法替布和甲氨蝶呤化合物的活性成分和其2D 和3D 结构（图1）。利用PharmMapper 数据库得到托法替布预测药效团模型的特征元素：如表1A 所示，托法替布预测药效团模型的主要蛋白结构分别为2ecd_A_cavity_2、2qq5_A_cavity_2、2cfv_A_cavity_2等，其支持靶点蛋白的特征数目均大于3，校正分值均大于0.8，靶点基因分别为ABL2、DHRS1、PTPRJ等；如表1B 所示，甲氨蝶呤药效团模型的主要蛋白结 构 分 别 为 3cki_B_cavity_3、1hi5_A_cavity_1、1n46_B_cavity_1 等，其支持靶点蛋白的特征数目均大于4，校正分值均大于0.6，靶点基因分别为ADAM17、RNASE2、THRB 等。最终鉴定出托法替布71 个和甲氨蝶呤66 个潜在的靶蛋白/基因，且两种药物的所有蛋白/基因均用于进一步研究。

表1 托法替布和甲氨蝶呤的预测药效团模型的主要特征因素Tab1 The main characteristic factors of predictivepharmacophore models of tofacitinib and methotrexate

图1 托法替布和甲氨蝶呤活性化合物的结构Fig 1 The structures of active compounds of tofacitinib and methotrexate

2.2 PPI 网络构建和可视化网络分析 将托法替布和甲氨蝶呤的所有预测靶蛋白/基因导入STRING数据库，构建共同靶点之间的相互作用关系图。如图2A 所示，在过滤值为0.96 条件下，得到托法替布和甲氨蝶呤共有206 对预测靶蛋白/基因。两者的主要预测靶蛋白/基因为JAK2、JAK3、STAT1、蛋白激酶B（AKT）1、白细胞介素（IL）-2、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）1、MAPK8、表皮生长因子受体（EGFR）等，靶蛋白/基因之间多通过融合（红色连线）、邻接（绿色连线）、同现（蓝色连线）等进行相互作用。进而采用Cytoscape（v 3.7.2）软件，将两种药物之间的相互调控关系进行网络可视化。如图2B 所示，此网络共有105 个预测靶蛋白/基因和349 条连线，其交互关系与图2A 一致。

图2 托法替布和甲氨蝶呤的预测靶点PPI 网络及网络可视化Fig 2 PPI network and network visualization for the predictive targets of tofacitinib and methotrexate

2.3 GO 功能富集分析 为进一步研究托法替布和甲氨蝶呤的可能作用机制，采用R x64 3.5.2 软件进行了GO 功能富集分析，并将结果绘制成气泡图。如图3A 所示，托法替布和甲氨蝶呤的预测靶蛋白/基因在影响受损DNA 结合、ATP 酶结合、核受体活性、转录因子活性、直接配体调控序列特异性DNA结合、类固醇激素受体活性、生长因子受体结合和内肽酶活性等功能处显著富集（均P＜0.05）。且据图3B 所示，托法替布和甲氨蝶呤的预测靶蛋白/基因在影响ATP 酶结合（P=0.002）、受损DNA 结合（P=0.002）、核受体活性（P=0.002）、转录因子活性、直接配体调控序列特异性DNA 结合（P=0.002）功能上富集最显著，而在影响类固醇激素受体活性（P=0.004）、生长因子受体结合（P=0.022）、内肽酶活性（P=0.029）方面次之。提示托法替布和甲氨蝶呤可能通过调控以上多种生物功能治疗RA。

图3 托法替布和甲氨蝶呤的预测靶点的GO 功能富集分析Fig 3 GO enrichment analysis of the predictive targets of tofacitinib and methotrexate

2.4 KEGG 通路富集分析 对托法替布和甲氨蝶呤的可能循坏通路进行KEGG 分析，如图4A~C 所示，HER2/neu、E2F、Rac、JNK、Ral、血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶（MMP）s、HBEGF、ERBB2、HER2、Notch、雌激素受体（ER）等可能是托法替布和甲氨蝶呤的预测靶蛋白/基因，JAK-STAT 信号通路、转化生长因子（TGF）-β 信号通路、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKT 信号通路、p53 信号通路、Ras 信号通路、MAPK 信号通路、血管内皮生长因子信号通路、核因子（NF）-κB 信号通路、Notch 信号通路和癌症通路等信号通路主要参与了托法替布和甲氨蝶呤共同作用的通路循坏。

图4 托法替布和甲氨蝶呤治疗多种疾病的KEGG 通路循环图Fig 4 KEGG pathway circulation diagram of tofacitinib and methotrexate in the treatment of various diseases

3 讨论

RA 是一种由大量的炎症细胞浸润、形成血管翳和滑膜炎、并侵犯邻近关节软骨导致骨破坏的自身免疫性疾病[10-11]。甲氨蝶呤一直是临床治疗RA 的常规用药，但对重症和甲氨蝶呤耐药的RA 患者疗效欠佳。近来临床研究发现，新研制的药物托法替布优于甲氨蝶呤或安慰剂，且托法替布联合甲氨蝶呤对RA 患者表现出更好的治疗效果[8，12]。托法替布作为一种处于Ⅲ期临床试验的新药，通过采用网络药理学的方法对其进行系统和详尽的研究，探讨其靶基因及相互作用，有助于更好地确定药物适应证和不良反应。本研究打破单一药理学研究的局限性，全面地研究并阐述了托法替布联用甲氨蝶呤的作用机制。

本研究通过pubchem 和PharmMapper 数据库分别获取了托法替布和甲氨蝶呤相关化合物的有效成分，并最终鉴定出137 个潜在靶蛋白/基因。其中 包 括 JAK2、JAK3、STAT1、AKT1、IL2、MAPK1、MAPK8、EGFR 等。最后通过GO 功能富集和KEGG 通路分析证实托法替布联合甲氨蝶呤治疗RA 的机制主要与JAK-STAT、TGF-β、PI3K-AKT、p53、Ras、MAPK、VEGF、NF-κB 及Notch 等信号通路密切相关。托法替布作为JAK 特异性抑制剂[13]，是由4 个非受体酪氨酸激酶（JAK1、JAK2、JAK3 和酪氨酸激酶2）组成，对应不同的细胞因子受体。非受体酪氨酸激酶与细胞因子受体结合后可抑制受体相关的JAK，阻碍下游的STATs 被JAK 磷酸化，导致受体无法解离并转移到细胞核调节基因转录，从而影响JAK-STAT 信号通路[14]。托法替布不仅减少了致RA 发病的关键基因（基质金属蛋白酶1 等）的表达，而且减少滑膜STAT1 和STAT3 的磷酸化水平，对RA 具有较好的治疗效果[15]。而且STAT 靶基因与NF-κB 信号通路靶基因高度相关，后者则是另一个促炎的关键信号通路。肿瘤癌变过程中，特别是微环境中肿瘤细胞和免疫细胞的相互作用时，STAT 信号往往是上调的，其上调涉及的生物过程包括分化、增殖、血管生成和细胞凋亡等。托法替布则通过干扰DNA 转录，从而对自身免疫性疾病RA 和肿瘤的相关炎性细胞的活性起到负性调控作用[16-17]。本研究结果亦证实，JAK2、JAK3、STAT1等是托法替布和甲氨蝶呤共同作用的靶蛋白/基因，其参与的JAK-STAT 信号通路与治疗RA 的过程密切相关。此外，托法替布可以通过抑制JAK-STAT 信号通路，影响DNA 的表达，从而治疗RA[18-19]，与本研究结果一致。目前JAK-STAT 是RA 致病的最重要的信号通路，是本研究网络中最重要的节点，其上下游因子亦是未来需要重点研究的目标。

炎症因子是RA 发病和进展的关键功能分子[20]。既往研究发现，IL-2 是参与RA 发生、发展的重要炎症因子，主要与MAPK 蛋白家族具有一定的关联性。IL-2 与活化T 细胞上的IL-2R 特异性结合后，进而激活具有GTP 酶活性的小蛋白Ras，Ras 进一步激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的Raf 蛋白，最终启动p42/p44MAPK，其通过以上过程促进T 细胞增殖，并引发炎症因子大量释放，造成免疫功能紊乱[21-22]。本研究亦证实IL-2、MAPK 是托法替布和甲氨蝶呤的主要靶蛋白/基因，且MAPK 信号通路在其间发挥着重要的作用。此外，胡志平等[23]研究证实通过抑制PI3K-AKT 通路可以减轻RA 大鼠的炎症。Harris 等[24]和Smith 等[25]发现PI3K-AKT 信号通路广泛存在于RA 的滑膜细胞中，且处于异常激活状态，是造成滑膜细胞失衡凋亡的原因之一。当应用PI3K 抑制剂ZSTK474 后，能明显改善胶原诱导的小鼠关节炎症状，证实其具有较好的抗RA 作用[26]。洪宏海等[27]还发现p53 具有抗RA 的免疫炎症作用。这些通路多与炎性免疫反应过程有关，本研究中亦体现了以上通路。

VEGF 是RA 病理性血管生成的重要参与者，促使血管翳形成，引起骨破坏[28]。雌激素可调控基质金属蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3，MMP3），促使成骨细胞膜表面的凋亡基因FasL 断裂成为可溶性FasL，诱导破骨细胞凋亡，减少骨破坏[29]。与本研究结果相符。本研究亦发现AKT1 与自噬性死亡相关[5]，EGFR 抑制剂能够诱导自噬[30]，重组人颗粒体蛋白前体通过MAPK 通路调控自噬[31]，STAT3 影响自噬相关基因的转录[32]，由此提示托法替布联合甲氨蝶呤可能通过抑制血管形成和细胞自噬而起到治疗RA 的作用。

综上所述，托法替布联合甲氨蝶呤在临床试验中取得了较好的疗效，但是缺乏系统科学的分子机制研究。本研究采用网络药理学的方法，对两者的活性成分、靶蛋白/基因和作用通路进行了深入探讨，证实托法替布联合甲氨蝶呤具有多靶点、多通路的作用特点，为后续研究提供理论依据，并未临床应用实践提供数据参考。由于现有数据的局限性，后期需要更多、更深入的研究为临床应用提供科学根据。