髓系特异性SOCS3 基因敲除小鼠的构建及应用

纪辰燕，李星晨，陈桂冬，于津浦

（天津医科大学肿瘤医院肿瘤分子诊断中心，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津恶性肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤免疫与生物治疗重点实验室，天津 300060）

髓系来源抑制细胞（MDSCs）是由不同分化阶段的髓系细胞构成的一群异质性细胞[1]。MDSCs 可以通过抑制抗肿瘤免疫反应，促进肿瘤的免疫逃逸[2]。同时，MDSCs 可以通过分泌血管内皮生长因子（VEGF）等生长因子，促进肿瘤局部血管生成[3]；或通过促进肿瘤细胞发生上皮间充质转化（EMT），升高肿瘤干细胞（CSCs）的比例等途径，直接促进肿瘤的生长和转移[4-5]。根据表型差异，MDSCs 可分为单核MDSCs（M-MDSCs）、多形核MDSCs（PMN-MDSCs）和早期MDSCs（eMDSCs）。eMDSCs 是一种新发现的亚群，具有不成熟表型Lin-HLA-DR-CD33+[1]，可分化为M-MDSCs[6]。eMDSCs 已被证实在肾细胞癌、头颈部癌、黑色素瘤和卵巢癌中存在，但是其免疫抑制功能尚未被证实，目前缺乏针对肿瘤eMDSCs 研究的荷瘤鼠模型[7-8]。前期研究中，笔者在构建的4T1 乳腺癌小鼠模型中发现一群表型特征为CD11b+Gr-1-F4/80-MHCII-的eMDSCs。与经典MDSCs 相比，这群eMDSCs 具有更强的免疫抑制功能，且能转变成经典CD11b+Gr-1+MDSCs。且笔者研究发现，SOCS3 基因表达降低能影响髓系祖细胞的分化，促进eMDSCs 的产生[9-10]。基于上述机制，笔者利用Cre-loxP 系统构建髓系特异性SOCS3 基因敲除小鼠，并对其接种乳腺癌E0771 细胞、肺癌Lewis 细胞、黑色素瘤B16 细胞，构建3 种eMDSCs 高浸润的荷瘤鼠模型，为研究eMDSCs 促进肿瘤的分子机制和探索针对eMDSCs 的靶向药物提供了重要的实验平台。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 7 只SPF 级SOCS3fl/-杂合子小鼠（4 雄3 雌），6～8 周龄，18～22 g，1 只SPF 级雄性Lyz2-Cre 鼠，7 周龄，20 g，均购于广州赛业生物技术有限公司[SCXK（苏）2020-0006]，两种小鼠遗传背景皆为C57BL/6J。SPF 级野生型C57BL/6J 小鼠雌、雄各3 只，6～8 周龄，18～22 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司[（SYXK（京）2019-0010）]。所有引进小鼠饲养于天津医科大学肿瘤医院实验动物中心[（SYXK（津）2017-0005）]，按照SPF 级标准饲养，室温（23±3）℃，12 h 光照/黑暗循环，自由取食、饮水，动物实验经天津医科大学肿瘤医院动物实验伦理委员会批准（AE-2021013），并按照《实验动物护理与指南》进行。

1.1.2 细胞系 本研究中使用的小鼠乳腺癌E0771细胞株购自中国医学科学院，小鼠肺腺癌LLC（Lewis lung cancer）细胞株购自广州赛库生物技术有限公司，小鼠黑色素瘤B16（B16 melanoma）细胞株购自ATCC，皆用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培养基于37℃、5%CO2恒温培养箱培养。

1.1.3 实验材料 快速DNA 提取扩增套装（天根生化科技有限公司），DNATrziol（Invitrogen 有限公司），RT Response Kit、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa），CD11b Micro Beads、Anti-Gr-1 antibodies、Anti-Biotin MicroBeads（美天旎生物有限公司），红细胞裂解液（碧云天），GAPDH 抗体、SOCS3 抗体（CST），羊抗鼠IgG 单克隆抗体、羊抗兔IgG 单克隆抗体（中杉金桥），Percp-anti-CD45 抗体、PE-anti-Gr-1 抗体、PE-anti-F4/80 抗体、FITC-anti-CD11b 抗体、FITC BrdU Flow Kit、Apoptosis Detection Kit（BD 有限公司），APC anti-CD3 抗体（Biolegend 公司），Dynabeads®mouse T-Activator CD3/CD8（Gibio，美国），T Cell Isolation Kit（MiltenyiBiotec，美国）；荧光定量PCR仪（AB7500，Applied Biosystems，中国），普通PCR仪（BIO-RAD，美国），化学发光凝胶成像分析仪（BIO-RAD，美国）。

1.2 方法

1.2.1 SOCS3fl/-小鼠的构建 通过生物信息学分析验证小鼠基因组中SOCS3 基因的DNA 序列，并根据该序列构建敲除载体和基因打靶策略。酶切线性化载体，通过电穿孔法将上述线性化载体转入胚胎干细胞（ES 细胞），并通过药物进行抗药性筛选。通过PCR 鉴定同源重组ES 细胞克隆，并通过Southern 印迹分析进行确认。通过显微注射将同源重组ES 细胞移植到囊胚中，后将囊胚移植入代孕母鼠的子宫内获得子代嵌合体小鼠，将其与flp 工具鼠交配，获得去除抗药基因的SOCS3fl/-小鼠。

1.2.2 SOCS3fl/-小鼠的鉴定 SOCS3fl/-小鼠基因型鉴定方法如下。区域一上游引物F1（5′-GAAGATCC CTGATTCCCGTCATACTC-3′）和下游引物R1（5′-ATGGGGAGAGACACAAGAGCCCTA-3′）用于首次PCR 筛选，来自重组等位基因的240 bp 片段代表阳性小鼠。区域二上游引物F2（5′-CTGGGAAAACAGC CATCTATTCATCC-3′）和下游引物R2（5′-GTTGTTG CGTCTGCCCCAAACT-3′）用于PCR 再次确认，从阳性小鼠中扩增出来自重组等位基因的324 bp 片段。

1.2.3 髓系特异性SOCS3 基因敲除小鼠的繁育SOCS3fl/-小鼠自交，PCR 鉴定F2 代小鼠，筛选出SOCS3fl/fl小鼠。将SOCS3fl/fl小鼠与Lyz2-Cre 工具鼠杂交获得F3 代SOCS3fl/-LysM-Cre+/-小鼠。F3 代小鼠进行自交，获取髓系特异性SOCS3 基因敲除小鼠（SOCS3fl/flLysM-Cre+/+小鼠，SOCS3KO鼠）。

1.2.4 髓系特异性SOCS3 基因敲除小鼠的鉴定

1.2.4.1 DNA 提取 取鼠尾至无酶EP 管，将其打碎处理为细胞悬液，10 000 r/min 离心1 min，弃上清后加入200 μL 裂解缓冲液，震荡至彻底悬浮。加入20 μL蛋白酶K，混匀，56℃1 h，后95℃5 min 灭活蛋白酶K，12 000 r/min 离心5 min，取上清至新的无酶EP 管，4℃冰箱放置备用。

1.2.4.2 PCR 扩增 PCR 体系为20 μL，内含模板DNA 1μL，2×PCR Reagent 10 μL，正反向引物各0.5 μL，DEPC 水8 μL。使用PCR 扩增仪循环扩增，反应条件：预变性94℃，3 min；变性94℃，30 s；退火55℃，30 s，重复40 个循环；延伸72℃6 min。

1.2.4.3 琼脂糖电泳 取PCR 扩增后产物8 μL 进行琼脂糖凝胶电泳，检测产物大小。

1.2.4.4 SOCS3KO鼠基因组鉴定 首先对F4 代小鼠进行SOCS3fl/fl小鼠鉴定，然后取上述SOCS3fl/fl小鼠进行Cre 的鉴定，即LysM-Cre+/+小鼠鉴定，最后取SOCS3fl/flLysM-Cre+/+小鼠的髓系细胞进行SOCS3 基因敲除鉴定。SOCS3fl/fl小鼠基因组鉴定结果判断：上游引物F2 和下游引物R2 用于鉴定SOCS3fl/fl小鼠。PCR 结果判定：（1）只有一个条带，大小为324 bp，为SOCS3fl/fl小鼠。（2）只有一个条带，大小为186 bp，为野生型小鼠。（3）两个条带，分别为324、186 bp，为SOCS3fl/-小鼠。Cre 基因的鉴定：取F4 代SOCS3fl/fl小鼠进行Cre 基因的鉴定，PCR 结果判定：只有一个条带，大小为204 bp，为LysM-Cre+/+小鼠。Cre 基因鉴定的上游引物序列为5′-GAACGCACTGATTTCGACCA-3′，下游引物序列为5′-GCTAACC AGCGTTTTCGTTC-3′。最后取SOCS3KO鼠的髓系细胞进行鉴定，PCR 结果判定：（1）只有一个条带，大小为324 bp，Cre 基因表达不成功。（2）只有一个条带：520 bp，SOCS3KO鼠。髓系细胞SOCS3 基因鉴定的引物为上游引物F3、上游引物F2 和下游引物R2，F3序列为5′-ACTTCACGGCTGCCAACATCTG-3′。

1.2.5 Western 印迹 使用含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液分离总蛋白。蛋白质提取物通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分离，并湿转至PVDF 膜，用5%脱脂牛奶封闭1 h，并在SOCS3 抗体稀释液中4℃孵育过夜。然后在室温下加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的鼠或兔二抗，室温孵育1 h，用Chemiluminescent HRP Substrate 显影液显影，利用Image J 软件定量分析SOCS3 蛋白的相对表达量（内参为GAPDH）。

1.2.6 流式细胞术 取小鼠骨髓，用70 μm 滤网过滤后裂解红细胞，再次用70 μm 滤网过滤，PBS 清洗并按5×105个/100 μL 重悬，流式管加100 μL 骨髓细胞悬液备用。肿瘤组织充分研磨后进行过滤，PBS 清洗后按5×105个/100 μL 重悬，流式管加100 μL 肿瘤细胞单细胞悬液备用。在每管中分别加入Percp-anti-CD45 抗体、FITC-anti-CD11b 抗体、PEanti-Gr-1 抗体、PE-anti-MHC II 抗体、PE-anti-F4/80 抗体各2.5 μL，震荡均匀后室温孵育20 min，PBS 清洗，流式细胞仪检测。

1.2.7 Annexin V 检测T 细胞凋亡 将T 细胞与CD11b+Gr-1-的骨髓细胞、SOCS3KO鼠eMDSCs、肿瘤原位eMDSCs 按照1∶3 比例共培养，培养过程中加CD3/CD8 抗体刺激T 细胞活化。72 h 后收集T 细胞，PBS 清洗，结合缓冲液按2×105个细胞/100 μL重悬，取100 μL 悬液于流式管中备用。加入2.5 μL APC-anti-CD3 抗体，室温避光孵育20 min，PBS 清洗后用100 μL 结合缓冲液重悬，加入5 μL Annexin V 和5 μL 7-AAD，室温避光孵育15 min，使用流式细胞仪检测。

1.2.8 Brdu 检测T 细胞增殖 将T 细胞与CD11b+Gr-1-髓系细胞、SOCS3KO鼠骨髓中的eMDSCs、肿瘤原位eMDSCs 按照1∶3 比例共培养，培养过程中加CD3/CD8 抗体刺激T 细胞活化。72 h 后收集T 细胞，PBS 清洗，结合缓冲液按2×105个细胞/100 μL重悬，取100 μL 悬液于流式管中备用。加入2.5 μL APC-anti-CD3 抗体，室温孵育20 min，PBS 清洗。加入100 μL Cytofix/Cytoperm Buffer，4℃避光孵育20 min，Perm/wash buffer 清洗。加入Cytofix/Cytoperm Buffer Plus 100 μL，4℃避光孵育10 min 后，Perm/wash buffer 清洗。加入100 μL Cytofix/Cytoperm Buffer，4℃避光孵育5 min，Perm/wash buffer 清洗。加入Dnase，37℃水浴孵育1 h，Perm/wash buffer清洗。加入稀释的Brdu 抗体50 μL，室温避光孵育20 min，Perm/wash buffer 清洗，重悬细胞后上机检测。

1.2.9 动物实验 将处于对数生长期的E0771 细胞按照2×106/（120 μL·只），皮下接种野生型C57BL/6J小鼠（WT 鼠）和SOCS3 敲除小鼠（雌性，6～8 周龄，18～22 g）第4 乳腺脂肪垫上，将LLC 按1×106/（120 μL·只）、B16 按照5×105/（120 μL·只），皮下接种野生型小鼠和SOCS3KO小鼠（雌性，6～8 周龄，18～22 g）腹股沟，每3 d 观察肿瘤的生长状况，测量肿瘤长短径，连续进行3 周，计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。公式：体积=ab2/2（a 为长径，b 为短径）。

2 结果

2.1 SOCS3fl/-小鼠的构建 SOCS3fl/-小鼠构建方式如图1 所示。将上述小鼠与flp 工具鼠交配，获得去除抗药基因的SOCS3fl/-小鼠7 只。

图1 SOCS3fl/-小鼠构建方式及鉴定位点Fig 1 Construction methods and identification sites of SOCS3fl/-mice

2.2 PCR 鉴定SOCS3fl/-小鼠结果 二步法鉴定SOCS3fl/-小鼠，通过PCR 对区域一进行鉴定，取上述鉴定结果为阳性的小鼠，对其区域二再次鉴定，最终获得SOCS3fl/-小鼠。如图2 所示，F1 代SOCS3fl/-小鼠区域一的扩增产物为240 bp 和166 bp 两条DNA片段，区域二的扩增产物为324 bp 和186 bp 两条DNA 片段，与预期结果一致，而WT 小鼠区域一的扩增产物为一条166 bp 的DNA 片段，区域二的扩增产物为一条186 bp 的DNA 片段。

图2 SOCS3fl/-小鼠DNA PCR 鉴定Fig 2 Results of genotype identification in SOCS3fl/-mice by PCR

2.3 髓系特异性SOCS3 基因敲除小鼠的繁育 髓系特异性SOCS3 基因敲除小鼠的繁育方式如图3 所示。将SOCS3fl/-小鼠自交，取获得的子代小鼠进行PCR 鉴定，筛选出SOCS3fl/fl小鼠。将SOCS3fl/fl小鼠与Lyz2-Cre 工具鼠杂交获得F3 代SOCS3fl/-LysM-Cre+/-小鼠。将F3 代小鼠进行自交获取髓系特异性SOCS3基因敲除小鼠（SOCS3fl/flLysM-Cre+/+小鼠，SOCS3KO鼠）。

图3 髓系特异性SOCS3 基因敲除小鼠的构建Fig 3 Construction of myeloid-specific SOCS3 gene knockout mice

2.4 SOCS3KO小鼠的鉴定结果 SOCS3KO小鼠为携带Cre 基因的SOCS3fl/fl小鼠，其基因型为SOCS3fl/flLysM-Cre+/+。取F4 代小鼠鼠尾进行PCR 鉴定，其中SOCS3fl/fl小鼠扩增产物为一条324 bp 的DNA 片段，对上述SOCS3fl/fl小鼠的Cre 基因进行进一步鉴定，扩增产物为一条204 bp DNA 片段的小鼠即为SOCS3KO小鼠，见图4A、4B。SOCS3KO小鼠的SOCS3基因在髓系细胞中被特异性敲除，其基因型如图4C所示。通过PCR 对F4 代SOCS3KO小鼠的髓系细胞进行了鉴定，与预期一致，扩增产物出现一条520 bp的DNA 片段，见图4D。结果显示，与Cre 工具鼠相比，SOCS3KO小鼠髓系细胞中SOCS3 蛋白表达显著降低，而肠组织、皮肤和肝脏中SOCS3 蛋白表达无显著变化，见图4E。

图4 SOCS3KO 小鼠鉴定Fig 4 Identification of SOCS3KO mice

2.5 髓系SOCS3 基因的敲除促进eMDSCs的生成和免疫抑制活性 如图5A 所示，在敲除SOCS3 基因后，小鼠骨髓中表型为CD11b+Gr-1-F4/80-MHCII-的eMDSCs 比例显著升高[（10.54±0.50）%vs.（40.5±2.85）%，t=17.94，P＜0.001]。与CD11b+Gr-1+细胞相比，肿瘤原位eMDSCs（t-eMDSCs）可显著抑制T 细胞增殖[（18.80±0.76）% vs.（9.54±0.67）%，t=15.95，P＜0.001）]，促进T 细胞凋亡[（8.33±0.75）% vs.（18.69±0.61）%，t=18.48，P＜0.001）]。SOCS3KO小鼠骨髓中分选的eMDSCs 免疫抑制活性与肿瘤原位eMDSCs 相似，也可显著抑制T 细胞增殖[（18.80±0.76）%vs.（9.95±0.77）%，t=14.21，P＜0.001]，促进T细胞凋亡[（8.33±0.75）% vs.（16.9±0.79）%，t=13.53，P＜0.001]，见图5B、5C。

图5 特异性SOCS3 基因敲除对eMDSCs 的生成和免疫抑制功能的影响Fig 5 Effects of specific SOCS3 gene knockout on the production and immunosuppressive function of eMDSCs

2.6 髓系SOCS3 基因的敲除促进肿瘤生长和eMDSCs 的浸润 为构建eMDSCs 高浸润的荷瘤鼠模型，分别将B16、E0771 与LLC 细胞接种到WT 小鼠和SOCS3KO小鼠皮下。结果显示，SOCS3KO组的黑色素瘤[（931.40±145.50）mm3vs.（293.60±96.16）mm3，t=6.90，P＜0.001]、乳腺癌[（377.9±36.12）mm3vs.（139.60±20.42）mm3，t=12.84，P＜0.001]、肺癌[（512.40±82.58）mm3vs.（240.20±28.14）mm3，t=6.98，P＜0.001]体积显著高于WT 组，见图6A、6B、6C。且流式结果表明，与WT组相比，SOCS3KO组黑色素瘤[（51.40±2.40）% vs.（88.80±1.20）%，t=24.14，P＜0.001]、乳腺癌[（19.10±0.90）% vs.（38.8±1.06）%，t=24.56，P ＜0.001]、肺 癌[（27.55±2.03）% vs.（46.90±0.95）%，t=14.93，P＜0.001]中的eMDSCs 比例显著升高，见图6D、6E、6F。

图6 髓系SOCS3 基因敲除对肿瘤生长和eMDSCs 浸润的影响Fig 6 Effect of SOCS3 gene knock-out on tumor growth and infiltration of eMDSCs

3 讨论

具有促肿瘤作用的MDSCs 最早发现于荷瘤鼠，后在肿瘤患者体内陆续被发现[11]。同时Lang 等[12]分析实体瘤患者外周血中MDSCs 的比例与患者总生存率的关系时发现，MDSCs 比例的增高降低了患者的总生存率，至此MDSCs 成为肿瘤研究的又一焦点。研究证实肿瘤组织中的MDSCs 促进了肺癌和结肠癌的远处转移[13-14]。临床试验，证实针对MDSCs的靶向治疗能抑制肿瘤生长，延长患者的生存期[15]，且抑制MDSCs 可以提高免疫检查点抑制剂的疗效[16-17]。总之，MDSCs 在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用。

MDSCs 由髓系祖细胞分化发育而来。正常情况下，髓系祖细胞可分化成为单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞，而在肿瘤患者体内，髓系祖细胞受到肿瘤细胞分泌的可溶性因子的调控，出现分化障碍，成为具有免疫抑制能力的MDSCs[18]。目前研究MDSCs时对其的获取主要包括3 个途径，一是直接从荷瘤小鼠的脾脏或肿瘤组织中分离MDSCs，二是通过白细胞介素-6（IL-6）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等细胞因子诱导髓系细胞增殖分化成MDSCs，三是直接建立MDSCs 干细胞系。上述方法各有其局限性，利用流式分选或磁珠分选从荷瘤鼠脾或肿瘤组织中获得的MDSCs 虽然得到纯化，但数量很少；而肿瘤细胞在体外培养或体内接种过程中会出现优势生长，干扰实验结果；体外诱导法存在MDSCs 分化效率低的问题[19-20]。因此，MDSCs 相关研究受到现有方法的限制。

本研究发现MDSCs 的亚群eMDSCs 的生成受肿瘤源性IL-6 影响。正常生理状况下，IL-6 引起一过性Janus 激酶/信号转导和转录激活因子（JAK/STAT3）通路激活，但肿瘤源性IL-6 可诱导髓系细胞中SOCS3 的缺失，导致JAK/STAT3 通路持续激活，从而促进了eMDSCs 的生成和扩增[9-10]。本研究利用Cre-loxP 系统成功构建了髓系特异性SOCS3基因敲除小鼠，对其进行基因型鉴定和蛋白水平上的敲除效果验证，确认SOCS3 基因在髓系细胞中特异性敲除。流式细胞学技术比较髓系特异性SOCS3基因敲除小鼠与野生型小鼠骨髓中eMDSCs 数量的结果显示，前者eMDSCs 数量显著升高，可达到髓系细胞的40%，且该群eMDSCs 具有与肿瘤原位eMDSCs 相似的免疫抑制功能，无肿瘤细胞污染，使得直接从小鼠骨髓中分离eMDSCs 的新获取方法成为可能。同时，本研究将乳腺癌细胞E0771、肺癌细胞LLC、黑色素瘤细胞B16 接种到髓系特异性SOCS3 基因敲除小鼠皮下，通过流式细胞学技术比较髓系特异性SOCS3 基因敲除小鼠与野生型小鼠所形成的3 种不同瘤子中eMDSCs 比例，结果显示前者显著高于后者，证实3 种eMDSCs 高浸润的荷瘤鼠模型构建成功。

综上所述，本研究以特异性敲除小鼠髓系细胞中SOCS3 基因的方式，模拟肿瘤源性IL-6 对髓系细胞的调控作用，促进骨髓中的eMDSCs 的生成和扩增，为MDSCs 的获取提供了新的有效方法，为eMDSCs相关实验研究提供了稳定的细胞来源。且本研究在髓系特异性SOCS3 基因敲除小鼠的基础上首次构建了3 种eMDSCs 高浸润的荷瘤鼠模型，可以模拟临床上高eMDSCs 的肿瘤患者，为体内探索eMDSCs的促肿瘤机制，寻找新型靶向药物提供了有力的动物模型。