MIR-138-5p 通过靶向组蛋白去乙酰化酶调节心脏肥大

侯维纳，吕爱婷，孙琪青，冯迎军

（郑州大学附属儿童医院，河南省儿童医院，郑州儿童医院心内科，郑州 450000）

心脏肥大是对重度压力的生理反应，可使心脏功能恢复正常[1]。心肌细胞持续增大需要更多的氧气，而冠状动脉的血液供应不足，可导致心力衰竭甚至猝死[2]。尽管越来越多的文献研究了调节心脏肥大的分子靶点，但其详细的分子机制尚未全面了解。

MicroRNA（miRNA）是约19～25 个核苷酸的保守非编码单链RNA，它们通过与靶mRNA 的3′UTR结合来抑制翻译和（或）降解靶mRNA[3]。miRNA 通过调节其靶基因参与多种生物过程，如增殖、分化、凋亡、发育、血管生成和免疫应答[4]。如miR-142-3p是调节心脏中早期胚胎干细胞分化的重要因素，并且对心脏发育具有负面调节作用[5]。Roberto 等[6]发现MIR-138-5p 表达与骨肉瘤的预后有关；然而MIR-138-5p 在心肌肥大模型大鼠及心肌细胞中表达如何，发挥何作用尚不清楚。本研究通过成功构建压力超负荷心肌肥大大鼠模型（TAC）和心脏肥大体外模型，探究MIR-138-5p 在肥大心肌细胞的表达，对心脏肥大反应的作用及其初步机制，希望基于MIR-138-5p 的分子机制为改善心脏肥大提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 TAC 的建立 所有动物护理和实验均根据美国国立卫生研究院发布的《实验动物的护理和使用指南》（NIH 出版物，2011 年修订）和郑州大学第一附属医院动物护理和使用委员会的机构指南进行。从郑州大学第一附属医院实验动物中心[SCXK（豫）2017－0001] 购买了6 周龄的成年雄性Sprague-Dawley 鼠，体重约200～250 g，共20 只，每组10 只。根据以前文献，进行腹主动脉缩窄术。用水合氯醛（350 mg/kg，腹膜内）麻醉大鼠，开胸后，用弯头眼科镊轻柔分离腹主动脉，横贯腹主动脉，然后用26 号针头将6-0 丝线缝合在主动脉周围，导致主动脉腔部分狭窄。在假手术组中，除没有主动脉缝合，其余步骤与TAC 手术相同。然后将实验分为2 组，即主动脉缩窄组（AB）和假手术组（Sham）。

1.2 组织病理学 分析手术切除左心室组织，在10%福尔马林缓冲液中固定，石蜡包埋，切成5 μm 厚的切片。用苏木精-曙红染色，并在光学显微镜下观察。

1.3 心肌细胞培养和实验方案 将大鼠H9c2 心肌细胞（中国科学院，上海，中国）接种到含有10%胎牛血清（HyClone，South Logan，UT）的Dulbecco 改良的Eagle 培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA）中，放置在37℃和5%CO2恒温箱中培养。为了构建体外心脏肥大模型，将H9c2 细胞用浓度为1.0 mmol/L 的血管紧张素Ⅱ（AngⅡ，Sigma-Aldrich.St.Louis，MI）处理24 h，将细胞分为Con 组和AngⅡ组。

1.4 实时定量PCR 根据制造商说明书，使用TRIzol 试剂（Life.Technologies，Carlsbad，CA）从样品中提取总RNA；cDNA 合成后（All-in-One First-Strand cDNA Synthesis 试剂盒，GeneCopoeia Inc，Santa Cruz，CA），使用MIR-138-5p 对应的引物，在ABI 75 00HT 系统（Applied Biosystems，Foster City，CA）上使用All-in-One qPCR Mix（GeneCopoeiaInc，USA）进行实时定量PCR（qRT-PCR）；β-肌动蛋白用作内部对照，进行重复反应对于每个样品，使用2-ΔCT方法计算基因表达的相对变化；每个实验的所有样品一式两份进行。

1.5 MIR-138-5p 的过表达 基因过表达质粒，包括pcDNA3.1/CCCTC 结合因子（CTCF）、pcDNA3.1/SNHG16、pcDNA3.1/IGF1 和相对阴性对照（NC，pcDNA3.1）以及MIR-183-5p 模拟物（miR-mimic）和对照模拟物（miR-NC）均购自上海基因制药（中国）。将大鼠H9c2 心肌细胞接种在6 孔板中，使用补充有10%FBS 的RPMI 1640 培养基培养。使 用Opti-MEM Reduced Serum Medium（Gibco，Carlsbad，CA，USA）在第2 天当细胞丰度约60%～70%时，每个孔加入等量（200 nmol/L）的miR-mimic和miR -NC， 用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）转染细胞。6 h 后，将培养基更换为补充有2% FBS 的RPMI 1640，转染48 h 后，用AngⅡ处理细胞，24 h 后收集细胞，并通过定量RTPCR 或蛋白质印迹进行分析，将细胞分为Con 组（生理盐水+生理盐水）、AngⅡ组（1.0 mmol/L 的AngⅡ+生理盐水）、AngⅡ+ miR-NC（1.0 mmol/L 的AngⅡ+200 nmol/L MIR-NC）、AngⅡ+ MIR-138-5pmimic 组（1.0 mmol/L 的AngⅡ+200 nmol/L MIR-138-5p- mimic），共4 组。

1.6 共转染细胞系构建 靶向大鼠组蛋白去乙酰化酶（HDAC）4cDNA 的siRNA 序列由GenePharma设计和合成。siRNA 序列如下：5′-GCGGAAAUGUUAAGAGAUU-3′，合并乱序的siRNA 作为阴性对照。 编码不含miR-138-5p 响应性3′-UTR 的全长人HDAC4 cDNA 开放阅读框（ORF）的哺乳动物表达质粒购自Invitrogen。空质粒用作阴性对照。根据制造商的说明书，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA），将NC+pcDNA-Con、miR-138-5p-mimic+pcDNA-Con 和miR-138-5p-mimic+pcDNA-HDAC4（Sino Biological Inc.）共转染大鼠H9c2 心肌细胞。将细胞分为Con 组（生理盐水+生理盐水）、AngⅡ组（1.0 mmol/L 的AngⅡ+生理盐水）、AngⅡ+ MIR-NC（1.0 mmol/L 的AngⅡ+200 nmol/L MIR-NC）、AngⅡ+MIR-138-5p-mimic 组（1.0 mmol/L 的AngⅡ+200 nmol/L MIR-138-5p-mimic）和AngⅡ+ MIR-138-5p- mimic+ pcDNA- HDAC4（1.0 mmol/L 的AngⅡ+200 nmol/L MIR-138-5p-mimic+pcDNA-HDAC4 混合物）组，共5 组。

1.7 荧光素酶活性测定 通过PCR 扩增HDAC4基因的3′UTR 区段并插入载体中。使用Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit（Agilent）产 生破坏HDAC4 3′UTR 区域的miR-138-5p 结合位点的突变构建体。使用Lipofectamine 200（Invitrogen）将具有miR-138-5p 模拟物的HDAC4 3′UTR或mut-HDAC4 3′UTR 质粒共转染到细胞中。转染48 h 后，通过双荧光素酶报告分析系统（Promega）分析荧光素酶活性。

1.8 免疫荧光（IF）染色 首先将固定在4%甲醛中的心肌细胞在0.1%Triton X-100 中渗透45 min，然后在4℃下用α-actinin 抗体（Abcam，Cambridge，UK）处理过夜。与二抗孵育1 h 后，将H9c2 细胞在4′，6-二mid 基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液中培养，然后通过荧光显微镜（Carl Zeiss，Dublin，CA）进行IF捕获，使用Image-Pro Plus 6.0 软件进行细胞表面积测量。所有实验至少重复3 遍。

1.9 蛋白质提取和蛋白质印迹 根据制造商的说明，使用RIPA 裂解缓冲液（Beyotime，Shanghai，China）从培养的心肌细胞中提取总蛋白。收集上清液，用Pierce BCA 蛋白质测定试剂盒（Thermo Scientific，Rockford，IL，USA）计算蛋白质浓度。然后，通过10%SDS-PAGE分离等量的蛋白质并转移至PVDF 膜（Millipore，Bedford，MA，USA）。在室温下用5%脱脂乳封闭1 h后，将膜用一抗在4℃下免疫染色过夜，在TBST 中洗涤3 次，然后在室温下与辣根过氧化物酶-标记的二抗（Cell Signaling Technology，Danvers，MA）孵育1 h。用增强的化学发光试剂（Cell Signaling Technology Inc.，USA）检测条带信号。通过用GAPDH 抗体探测相同的印迹来标准化蛋白质水平。一抗购自以下来源：anti-ANF、anti-BNP、anti-β-MHC 及anti-GAPDH（Santa Cruz，CA，USA）;使用image J 软件扫描和量化每个条带的强度。所有实验至少重复3 遍。

2 结果

2.1 MIR-138-5p 在压力负荷和AngⅡ引起的心肌肥大中的表达 建立AngⅡ诱导的原发性心肌肥大和TAC 大鼠模型。结果显示，与假手术组相比，AB组大鼠的心脏体积以及心脏横截面积明显增大（图1A），且心肌细胞中MIR-138-5p 的mRNA 水平均明显下降（图1B，F=21.578，P＜0.001）；相对于Con 组，AngⅡ组细胞表面积明显增大（图1C）;且心肌细胞中miR-138-5p 的mRNA 水平均明显下降（图1D，F=23.790，P＜0.001）。

图1 MIR-138-5p 在压力负荷和AngⅡ引起的心肌肥大中的表达情况Fig 1 The expression of MIR-138-5p in myocardial hypertrophy caused by pressure overload and AngⅡ

2.2 MIR-138-5p 过表达对AngⅡ诱导的的心肌肥大的影响 本实验通过α-肌动蛋白染色和Western印迹评估了各组心肌细胞的表面积心肌肥大标志蛋白表达情况，结果显示：与AngⅡ+ miR-NC 组相比，AngⅡ+MIR-138-5p-mimic 组心肌细胞中MIR-138-5p 表达明显增加（图2A）。与AngⅡ+MIR-NC组相比，AngⅡ+MIR-138-5p-mimic 组心肌细胞的表面积（图2B）和心肌肥大标志物表达均明显下降（图2D-F，F=9.532、11.199、8.125，均P＜0.01）。

图2 MIR-138-5p 过表达对AngⅡ诱导的心肌肥大的影响Fig 2 The effect of MIR-138-5p overexpression on Ang Ⅱ-induced cardiac hypertrophy

2.3 MIR-138-5p 与HDAC4 基因的靶点验证 结果显示，在WT 组中，miR-mimic 组的HDAC4 相对荧光素酶活性比miR-NC 组显著降低（图3A，F=22.578，P＜0.001）；而Mut 组中，两组的HDAC4 相对荧光素酶活性无统计学意义（图3A）。Western 印迹结果显示：与NC 组相比，miR-mimic 组HDAC4 蛋白水平表达显著下降（图3B，F=25.530，P＜0.001）。

图3 MIR-138-5p 与HDAC4 基因的靶点验证Fig 3 Target validation of MIR-138-5p and HDAC4 genes

2.4 miR-138-5p 通过靶向HDAC4 影响AngII 诱导的心肌肥大 本实验为了探究MIR-138-5p 抑制AngⅡ诱导的心肌肥大是否与HDAC4 表达有关，于是miR-138-5p 模拟物与HDAC4 共转化为H9c2细胞系，检测转染HDAC4 后miR-138-5p 模拟物H9c2 细胞的表面积及心肌肥大标志物的蛋白水平。结果显示，与AngⅡ组相比，AngⅡ+miR-138-5p-mimic组心肌细胞表面积明显减小，且其中心肌肥大标志蛋白表达明显降低（F=24.634、23.214、23.734，均P＜0.001），见图4；与AngⅡ+miR-138-5p-mimic 组相比，AngⅡ+miR-138-5p-mimic+pcDNA- HDAC4 组心肌细胞表面积明显增大，且其中心肌肥大标志蛋白表达明显升高（F=10.134，P＜0.01），见图4。

图4 miR-138-5p 通过靶向HDAC4 影响AngⅡ诱导的心肌肥大Fig 4 miR-138-5p affects AngⅡ-induced cardiac hypertrophy by targeting HDAC4

3 讨论

心肌肥大可有效补偿心肌的重负荷。然而，心肌细胞持续增大可能导致心脏负担过重，甚至有致死危险[7-8]。已有研究发现，大量的miRNAs 在心脏肥大中发挥重要作用。例如，miR-142-3p 的过表达通过调节线粒体功能，来改善心脏肥大[9]。然而，miR-138-5p 在心脏肥大中表达如何，发挥何作用及其分子机制尚未文献报道。

在本研究中，首次发现在压力TAC 大鼠模型和AngⅡ诱导的心肌肥大模型中，miR-138-5p 的表达明显下调。有研究发现，miRNA-138-5p 靶向NFIBSnail1 轴以抑制结直肠癌细胞迁移和化学耐药性[10]，也已证明其可通过靶向survivin 来促进膀胱癌细胞的增殖和侵袭[11]。然而，miRNA-138-5p 在心脏肥大中发挥何作用，尚不清楚。

为了探究miRNA-138-5p 对心脏肥大反应的作用，将miRNA-138-5p-mimic 转染到AngⅡ处理过的心肌细胞（H9c2），采用α-肌动蛋白染色和蛋白质免疫印迹方法检测心肌细胞的表面积和心肌肥大标志蛋白的表达情况，结果显示，相对于AngⅡ+miRNC 组，AngⅡ+miR-138-5p-mimic 组心肌细胞的表面积和心肌肥大标志蛋白，如心钠素（ANP）、脑钠肽（BNP）和β-肌球蛋白重链（β-MHC）表达均明显下降。这些发现表明，心肌细胞中miR-138-5p的过表达可以减弱心脏肥大反应。

接下来，笔者采用TargetScan 在线软件和荧光素酶测定法，发现miR-138-5p 可以干扰HDAC4 的基因表达，且RT-PCR 结果也证实了HDAC4 是miR-138-5p 的靶基因。

组蛋白脱乙酰基酶（HDACs）通过使组蛋白乙酰化或脱乙酰基化来控制各种生物过程，从而调节转录因子对基因启动子的可及性[12]。HDAC 分为4类：Ⅰ类HDAC（HDAC1、2、3 和8）、Ⅱ类HDAC（HDAC4、5、6、7、9 和10）、Ⅲ类HDAC（SIRT1-7）和Ⅳ类HDAC（HDAC11）[13]。有研究表明，HDAC4 可在多种组织中广泛表达，尤其是在脑[14]、心脏和骨骼肌中。在小鼠中，HDAC4 可减轻由神经支配引起的骨骼肌萎缩[15]。本研究已经证实miR-138-5p 可抑制心脏肥大反应，而且HDAC4 是miR-138-5p 的靶基因。但在心脏肥大反应中，miR-138-5p 和HDAC4的关系如何尚不清楚。

因此，在本实验中，笔者将miR-138-5p 模拟物和HDAC4 共转化到H9c2 心肌细胞系中，检测转染HDAC4 后的miR-138-5p 模拟物H9c2 的表面积和心肌肥大标志蛋白（如ANP、BNP 和β-MHC）水平。结果显示：相对于AngⅡ组，AngⅡ+ miR-138-5pmimic 组心肌细胞表面积明显减小，且其中心肌肥大标志蛋白表达明显降低（图4，F=24.634、23.214、23.734、均P＜0.001）；相对于AngⅡ+miR-138-5pmimic 组，Ang Ⅱ+miR-138-5p-mimic+pcDNAHDAC4 组心肌细胞表面积明显增大，且其中心肌肥大标志蛋白表达明显升高。总之，本数据进一步表明HDAC4 是miR-138-5p 的功能靶标，在心脏肥大反应中起重要作用。

综上所述，miR-138-5p 通过抑制其靶基因HDAC4，抑制心脏肥大反应，为临床改善心脏肥大提供了实验基础。