不同龄SD大鼠自发性良性前列腺增生的研究

马 允,侯冰燕,张 志,刘 颖,王文地,侯俊玲,3*,王文全,,3*

1.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所,北京 100193;2.北京中医药大学中药学院,北京 102488;3.中药材规范化生产教育部工程研究中心,北京 102488

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)是一种在中老年男性群体中的常见疾病,是由于过渡区和尿道周围的上皮组织和纤维肌肉组织的增生失调而导致的前列腺的良性扩大[1]。建立BPH模型应综合考虑发病机制和致病因素,由于BPH的确切发病机制仍未完全阐明,故自发性BPH模型最为接近人类实际临床状况,是研究BPH相关疾病较为理想的动物模型。目前研究较完备的可作为自发性BPH模型的实验动物有犬类和灵长类动物[2-3]。SD大鼠属于封闭群动物,在基因、毒理、代谢遗传多样性方面都比较接近于人类,且其衰老机制也与人类有诸多相似之处[4-5]。目前自然老化大鼠在BPH的药效研究中也有应用[6],但对于大鼠BPH发生情况与其年龄的相关性仍缺乏系统研究。本文选取4、8、12月龄3个年龄段的SD大鼠,分别对其表观指标脏器指数和BPH相关生化指标进行分析,旨在为SD大鼠自发性BPH模型的研究奠定理论基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

FA2004N型电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司);TDL5M型台式低速冷冻离心机(湖南赫西仪器装备有限公司);Multiskan MK3型酶标仪[赛默飞世尔(上海)分析仪器有限公司];DEM-3型自动洗板机(北京拓普分析仪器有限公司);SKP-02.600型电热恒温培养箱(黄石市恒丰医疗器械有限公司);JJ-12J型脱水机、JB-P5型包埋机均购自武汉俊杰电子有限公司;RM2016型病理切片机(上海徕卡仪器有限公司);B032型荧光倒置生物显微镜(尼康仪器上海有限公司)。

1.2 试药

双氢睾酮(dihydrotestosterone,DHT),睾酮(testosterone,T),表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF),胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor-1,IGF-1),B细胞淋巴瘤因子2(B-cell lymphoma factor 2,BCL-2),凋亡因子(BCL-2 associated X,BAX),超氧化歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒,均购自上海酶联生物科技有限公司;水合氯醛(批号20201017,陕西养元神生物科技有限公司);100 mL·L-1中性福尔马林溶液(批号20201212,北京益利精细化学品有限公司)。

1.3 动物

2、6、10月龄的SPF级雄性SD大鼠各6只,体质量分别为490～650 g、550～850 g和450～600 g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,许可证号SCXK(京)2019-0010。动物被安置在(22±2) ℃、相对湿度55%±5%的层流气流室中。在12 h明暗交替的循环中,给大鼠提供标准的实验室饮食,保证其自由饮水,所有大鼠于常规条件下适应性饲养2个月后用于实验。

2 方法

2.1 实验方法

将2、6、10月龄SD大鼠适应性饲养2个月,保证各年龄段大鼠生长环境完全一致后,将此时的4、8、12月龄雄性SD大鼠各6只禁食12 h,用体积分数为10%的水合氯醛按照0.003 mL·g-1进行腹腔注射麻醉,腹主动脉取血,血样于常温下静置2 h,以4 000 r·min-1离心15 min,收集血清,储存于-80 ℃,用DHT、T、EGF、IGF-1、BAX和BCl-2的ELISA试剂盒检测各组大鼠血清中各指标的含量。仔细采集各组大鼠的前列腺、睾丸、肝脏、肾脏、脾脏和胸腺,将各器官表面液及组织液吸干,称质量,计算脏器指数。脏器指数=脏器质量(mg)/体质量(g)。

将整个前列腺组织纵向一分为二,一半用100 mL·L-1中性福尔马林溶液固定,进行常规组织处理和HE染色;另一半称质量后,加入9倍体积的生理盐水,冰水浴条件下制备匀浆,以2 500 r·min-1,离心10 min,取上清液。用SOD和MDA的ELISA试剂盒检测各组大鼠前列腺组织内SOD及MDA的含量。

2.2 统计学方法

3 结果与分析

3.1 不同月龄SD大鼠脏器指数的变化

前列腺指数是临床诊断BPH的重要表观指标,在动物实验中,也可直接反映实验动物是否出现前列腺增生[7-8]。结果显示,8月龄组大鼠的前列腺指数较4月龄组有升高趋势,12月龄组大鼠的前列腺指数显著高于4月龄组(P<0.01),12月龄组与8月龄组相比差异无统计学意义。从表观指标前列腺指数来看,SD大鼠可能从12月龄或者更早即出现了一定程度的自发性BPH。一般采用雄激素诱导法等方法造模后,BPH大鼠的睾丸指数升高,实验中8月龄组大鼠的睾丸指数较4月龄组显著降低(P<0.01);12月龄组大鼠的睾丸指数显著低于4月龄组(P<0.05),但与8月龄组大鼠相比差异无统计学意义。实验中大鼠睾丸指数随月龄增长而降低,呈现出与人工造模不同的变化趋势。由于BPH是老年性疾病,肾脏、脾脏和胸腺等组织器官的质量变化可在一定程度上反映动物的衰老情况,故可参考肝脏指数、肾脏指数和脾指数等表观指标衡量动物的衰老情况[9]。不同年龄的大鼠中12月龄组的肝脏指数、肾脏指数和脾指数均为最低,但各组间的差异无统计学意义。胸腺是重要的免疫器官之一,与动物体内的体液免疫和细胞免疫均有关系,其体积萎缩减小和质量下降均可导致动物免疫功能的下降[10]。实验中8月龄组和12月龄组大鼠的胸腺指数较4月龄组显著降低(P<0.001)。结果见表1。

表1 各组大鼠脏器指数的比较

3.2 不同月龄SD大鼠血清生化指标的变化

目前的激素内分泌学说、生长因子学说和细胞凋亡学说等均在一定程度上解释了BPH的发病机制[11]。在激素内分泌学说中,雄激素可通过促进与抑制前列腺细胞的增殖和凋亡而导致前列腺增生,T和DHT都属于雄激素,T作用于前列腺细胞,在5α-还原酶的催化作用下转化为DHT,而DHT与雄激素受体的结合量是T的4～5倍[12],其在增生前列腺组织中的浓度一般高于正常组织。本实验中DHT的表达量随大鼠年龄的增长有升高趋势,但各组间的差异无统计学意义;各组间T表达量的差异也无统计学意义。

生长因子在前列腺的增生过程中发挥着重要作用,EGF通过作用于细胞膜上的受体,促进细胞分裂从而导致前列腺上皮细胞增生[13]。IGF-1可促进前列腺上皮细胞发生有丝分裂并且具有抗细胞凋亡的作用[14],一般在BPH中,EGF和IGF-1的表达量显著升高。本实验中,与4月龄组比较,8、12月龄组大鼠EGF的表达量显著升高(P<0.01),12月龄组与8月龄组相比有升高趋势但差异无统计学意义;与4月龄组比较,8、12月龄组大鼠IGF-1的表达量显著降低(P<0.01),12月龄组与8月龄组相比有降低趋势但差异无统计学意义。

越来越多的研究表明,细胞凋亡的减少是BPH的重要致病因素,BAX属于细胞凋亡促进基因,其表达量降低会导致细胞凋亡的减少,BCL-2属于细胞凋亡抑制基因,其表达量升高同样会导致细胞凋亡的减少[15]。本实验中,与4月龄比较,8月龄组大鼠和12月龄大鼠BAX的表达量显著降低,其中12月龄组比8月龄的降低趋势更加明显,12月龄组与8月龄组相比显著降低(P<0.05);BCl-2的表达量随年龄增长有下降趋势,但各组间的差异无统计学意义。结果见表2。

表2 各组大鼠血清生化指标的比较

3.3 不同月龄SD大鼠前列腺组织内生化指标的变化

研究表明,男性BPH患者血浆中氧化应激标志物的含量增加,氧化应激在BPH发生中的作用仍未完全阐明,但两者存在密切联系[16]。SOD是体内一种具有清除自由基作用的重要抗氧化酶,自由基作用于脂质发生过氧化反应,其产物MDA具有细胞毒性[17-18]。与4月龄组相比,8、12月龄组大鼠SOD的表达量有下降趋势,标准差偏高表明SOD表达量个体差异较大,各组间比较差异无统计学意义;8月龄组大鼠MDA的表达量显著高于4月龄组(P<0.05),其他各组间的差异无统计学意义。结果见表3。

表3 各组大鼠前列腺组织生化指标的比较

3.4 不同月龄SD大鼠前列腺组织的病理变化

4月龄组光镜下可见前列腺组织表现正常,上皮细胞排列整齐,呈立方状或柱状,腺腔内表面光滑,基本无乳头状向内突起;8月龄组上皮细胞排列较整齐,腺体增生不明显,有少量间质,腺腔内有少部分乳头状向内突起;12月龄组上皮细胞及组织间隙出现增生,腺上皮细胞排列较紊乱,部分细胞呈高柱状,间质较多,腺腔内有较多乳头状向内突起。4月龄组前列腺组织基本无增生,8、12月龄组增生程度递增。结果见图1。

注:A.4月龄组;B.8月龄组;C.12月龄组。

4 讨论与结论

BPH的发生与年龄密切相关,有研究指出[19],随着年龄的增长前列腺的体积逐渐增大,因此选择年龄合适的实验动物对于BPH的药效研究有重要意义。关于实验大鼠与人类年龄的相关性存在多种理论[20],本文通过非线性缩放理论计算SD大鼠的年龄[21],实验大鼠的平均寿命为2～3岁[22],本实验中4月龄SD大鼠相当于人类年龄16岁左右;8月龄相当于22岁左右;12月龄相当于40岁左右。但是要注意实验动物的年龄并不完全是人类年龄的微缩版,考虑年龄因素时应当结合解剖学、生理学和生物学现象综合分析。目前临床上普遍应用表观指标、生化指标和病理指标来判断前列腺增生程度。因此,本文通过结合表观指标、生化指标和病理指标对3个年龄段SD大鼠的自发性的前列腺增生程度进行系统分析。

依据表观指标前列腺指数,12月龄SD大鼠的前列腺即出现一定程度的增生;依据病理指标,随年龄增长,SD大鼠的前列腺组织增生程度逐渐加重;但生化指标结果显示,并非全部检测因子都达到BPH病理状态,DHT、T、SOD以及MDA虽未达到病理状态但有向病理状态变化的趋势。本实验中,DHT的表达量随大鼠月龄的增长有升高趋势,但各组间的差异无统计学意义;各组间T表达量的差异无统计学意义,可能在雄激素指标的表达量上12月龄SD大鼠还未出现显著性增长;BAX的表达量随年龄增长逐渐降低,8月龄开始出现明显降低,12月龄降低更加明显;各组间BCl-2表达量的差异无统计学意义,可能在BCl-2的表达量上12月龄SD大鼠还未出现显著性增长;EGF的表达量随年龄增长而升高,8月龄开始即出现显著性升高;IGF-1的表达量却随年龄的增长而降低,8月龄即出现明显降低。IGF-1具有通过与特异性受体结合,发挥调节机体代谢、促进细胞增殖分裂、降低血糖及调节免疫等作用[22],研究显示血循环中IGF-1的水平随衰老下降[23],但其促细胞分裂作用是一把双刃剑,既可以促进胎儿生长发育,维持成人体内合成与代谢,也会增加正常细胞转化为肿瘤细胞的风险以及促进BPH的发生,目前普遍认为其在BPH模型的前列腺组织中呈现高表达[24-26]。本实验中SD大鼠的IGF-1表达量随年龄增长而下降,表现出了与自然衰老相同、与人工造模相反的变化趋势。由于IGF-1的调节机制极为复杂,其在糖尿病和高血压患者血液中表达水平的升降也曾争议多年,因此老年BPH患者的确切IGF-1水平仍有待进一步研究。

综上所述,本实验中12月龄SD大鼠的前列腺组织出现一定程度的自发性增生,EGF和BAX的表达量均符合BPH病理状态的变化,DHT、SOD和MDA的表达量虽未完全达到病理状态,但呈现向病理状态变化的趋势,由此推断12月龄SD大鼠存在自发性BPH。但要注意的是,BPH的发生、发展是多种因素共同作用的结果,前列腺组织增生是众多生化指标综合作用的表观反映,并不局限于本实验所检测的生化指标,因此虽然本实验中12月龄组SD大鼠有部分生化指标的表达量未达到BPH病理状态,但其前列腺组织仍然出现增生。

自发性BPH大鼠模型由于其发病机制最为贴近临床,故在BPH的治疗及预防的研究中有较大应用价值。考虑本次实验所用SD大鼠最大为12月龄,在年龄上仍有一定局限性,后续将选用更高月龄SD大鼠进行自发性BPH模型的研究。