鱼藤素对小鼠神经母细胞瘤细胞恶性行为的作用及其机制

冯珏利,王 瑛,常新捷,步星耀

1.河南科技大学第一附属医院小儿外科,洛阳 471000;2.河南省人民医院神经外科,郑州 450000

神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童期最常见的颅外实体恶性肿瘤,可发生于外周交感神经系统的任何部位,局部或转移性的NB可在无干预情况下自发消退,但大龄儿童即使经过临床治疗仍可死于该病,约占所有儿童癌症死亡病例的15%[1-2]。鱼藤素是一种黄酮类化合物,可以有效抑制线粒体复合体Ⅰ酶的活力[3]。近年的研究显示,鱼藤素对多种肿瘤,如非小细胞肺癌、肝癌、胃癌等,具有良好的抗癌活性[4-6]。目前,有关鱼藤素治疗NB的研究较少,本研究以小鼠神经母细胞瘤细胞Neuro-2A为实验对象,探讨鱼藤素对其恶性生物学行为的影响及作用机制,为鱼藤素相关药物的研发及NB的临床治疗提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

全波长酶标仪(美国赛默飞世尔科技有限公司);流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 试药

鱼藤素、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),均购自美国Sigma公司;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);兔抗鼠细胞增殖核抗原67(antigen identified by monoclonal antibody 67,Ki67),活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved-caspase3),均购自美国Santa Cruz公司;兔抗鼠Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4),核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB),β-actin抗体以及辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的山羊抗兔IgG抗体均购自英国Abcam公司。

1.3 细胞株

小鼠神经母细胞瘤细胞Neuro-2A细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

2 方法

2.1 MTT法检测细胞增殖情况

取处于对数生长期的Neuro-2A细胞,调整细胞密度为1×105个·mL-1,接种至96孔板,每孔180 μL,培养过夜使细胞贴壁,加入不同浓度的鱼藤素20 μL,使其终浓度分别为0、0.01、0.1、1、10、100、1 000 nmol·L-1,设置3个复孔,培养48 h。每孔加质量浓度为5 mg·mL-1的MTT 20 μL,孵育4 h后弃上清,每孔加DMSO 150 μL,室温避光孵育5 min。用酶标仪检测490 nm波长处各孔的吸光度值A,实验重复3次,计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组A值÷对照组A值)×100%。应用Graphpad Prism7软件计算半数抑制浓度(IC50),并将其作为后续实验的干预浓度。另取细胞设置对照组、鱼藤素组、LPS组和鱼藤素+LPS组,鱼藤素组、LPS组分别加入15.6 nmol·L-1鱼藤素和质量浓度为10 μg·mL-1的LPS,鱼藤素+LPS组先加入15.6 nmol·L-1鱼藤素作用1 h,再加入质量浓度为10 μg·mL-1的LPS,对照组加入等体积细胞培养液作用48 h,检测细胞相对活力。细胞相对活力=实验组A值/对照组A值。

2.2 流式细胞术检测细胞凋亡

收集各组细胞,调整细胞密度为5×105个·mL-1,用PBS清洗2次,加入Binding Buffer 195 μL重悬细胞,加入Annexin V-FITC 5 μL,混匀后加入PI 10 μL,室温避光孵育15 min,用流式细胞仪检测,用CellQuest软件分析细胞凋亡率,实验重复3次。

2.3 RT-PCR检测TLR4/NF-κB通路相关基因mRNA的表达水平

收集各组细胞,用PBS清洗2次,用Trizol试剂提取细胞总RNA,用超微量分光光度计检测其浓度和纯度。

反转录体系:5×Mix 4 μL,RNA 1 μg,加双蒸水至20 μL。反应程序:25 ℃,10 min;42 ℃,30 min;85 ℃,5 min。反转录产物稀释至1 mL作为cDNA。

荧光定量PCR反应体系:2×SYBR Green Master Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL,模板cDNA 2 μL,RNase-free ddH2O 6 μL。反应程序:95 ℃预变性60 s;95 ℃,15 s;60 ℃,15 s;72 ℃,45 s,共循环40次。目的基因RT-PCR引物用Primer3.0软件设计,序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

2.4 Western blot检测蛋白表达水平

收集各组细胞,加入RIPA裂解液后于冰上孵育0.5 h,以3 000 r·min-1(离心半径10 cm)4 ℃离心5 min,取上清,用BCA法检测蛋白浓度。加5×SDS loading buffer,金属浴95 ℃加热10 min,使蛋白变性,用体积分数10%的SDS-PAGE分离目的蛋白,用转膜仪将其转移至PVDF膜,用质量浓度50 g·L-1的脱脂奶粉室温封闭1 h,分别加入1∶1 000稀释的Ki67、cleaved-caspase3、TLR4、NF-κB p65和p-p65抗体,4 ℃孵育过夜,用TBST洗膜3次,加入1∶2 000稀释的经HRP标记的二抗,室温孵育1 h,用TBST洗膜3次,滴加ECL化学发光液,于暗室曝光显影,用Image J软件分析蛋白条带灰度值,计算目的蛋白的相对表达量。目的蛋白的相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参β-actin蛋白条带灰度值。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 鱼藤素对Neuro-2A细胞的生长抑制作用

不同浓度的鱼藤素作用于Neuro-2A细胞48 h后,细胞的生长受到明显抑制,随着鱼藤素浓度的升高,细胞的存活率降低(P<0.05)。鱼藤素作用48 h对Neuro-2A细胞的IC50为15.6 nmol·L-1,后续实验选择15.6 nmol·L-1鱼藤素进行处理。结果见表2。

表2 各组细胞存活率的比较

3.2 各组Neuro-2A细胞相对活力的比较

细胞相对活力组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,鱼藤素组细胞的相对活力降低,LPS组细胞的相对活力增强(P<0.05);与鱼藤素组比较,鱼藤素+LPS组细胞的相对活力增强(P<0.05);与LPS组比较,鱼藤素+LPS组细胞的相对活力降低(P<0.05)。结果见表3。

表3 各组细胞相对活力的比较

3.3 各组Neuro-2A细胞凋亡率的比较

细胞凋亡率组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,鱼藤素组细胞的凋亡率升高,LPS组细胞的凋亡率降低(P<0.05);与鱼藤素组比较,鱼藤素+LPS组细胞的凋亡率降低(P<0.05);与LPS组比较,鱼藤素+LPS组细胞的凋亡率升高(P<0.05)。结果见表4。

表4 各组细胞凋亡率的比较

3.4 各组Neuro-2A细胞中TLR4、NF-κB mRNA表达水平的比较

比较各组细胞TLR4 mRNA的相对表达量,组间差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,鱼藤素组TLR4 mRNA的相对表达量降低,LPS组升高(P<0.05);与鱼藤素组比较,鱼藤素+LPS组升高(P<0.05);与LPS组比较,鱼藤素+LPS组降低(P<0.05)。各组细胞NF-κB mRNA的相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表5。

表5 各组细胞TLR4、NF-κB mRNA表达水平的比较

3.5 各组细胞蛋白表达水平的比较

比较各组细胞Ki67、cleaved-caspase3、TLR4、p-p65蛋白的相对表达量,组间差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,鱼藤素组Ki67、TLR4、p-p65蛋白的相对表达量降低,cleaved-caspase3蛋白的相对表达量升高(P<0.05),LPS组Ki67、TLR4、p-p65蛋白的相对表达量升高,cleaved-caspase3蛋白的相对表达量降低(P<0.05);与鱼藤素组比较,鱼藤素+LPS组Ki67、TLR4、p-p65蛋白的相对表达量升高,cleaved-caspase3蛋白的相对表达量降低(P<0.05);与LPS组比较,鱼藤素+LPS组Ki67、TLR4、p-p65蛋白的相对表达量降低,cleaved-caspase3蛋白的相对表达量升高(P<0.05),各组细胞NF-κB p65蛋白的相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表6和图1。

表6 各组细胞蛋白表达水平的比较

图1 各组细胞Ki67、cleaved-caspase3和TLR4/NF-κB通路蛋白的表达水平

4 讨论

NB是一种胚胎恶性肿瘤,可影响儿童早期肾上腺髓质和椎旁交感神经节的正常发育,占所有儿童期恶性肿瘤的8%～10%,其起源于神经嵴的肾上腺嗜铬细胞和交感神经元,具有基因组异常、肿瘤间和瘤内异质性等生物学特征[7-8]。ACKERMANN S等[9]根据NB基因组测序结果及分子特征将其分为端粒维持阴性和阳性2种表型。NB的发病机制包括原癌基因激活、扩增,抑癌基因失活或杂合性缺失,部分基因(如神经生长因子)表达失控,神经生长因子及多种信号转导途径(酪氨酸激酶受体介导的细胞信号途径)异常,肿瘤细胞恶性增殖、凋亡失常等。由于NB原发肿瘤小、恶性程度高、进展快,由于诊断时多为中晚期且NB部分侵袭性和高危NB患者疗效差、预后不佳,故也被称为儿童肿瘤之王。NB的临床治疗手段包括手术、放疗、化疗、免疫治疗、造血干细胞移植以及多方式联合治疗等,但治疗效果仍不理想,5年生存率仅为70%,其中,高危NB患者的治愈率低于40%[10]。因此,寻找低毒、高效、温和的新药物对提高NB的治疗效果、改善患者预后意义重大。

鱼藤素是一种从鱼藤属或灰叶属植物中提取的天然化合物,具有多种生物学效应,药理学研究证实,鱼藤素可通过阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡,抑制血管生成,阻碍细胞迁移、侵袭以及调控新陈代谢等发挥抑瘤作用[11]。WANG A等[12]研究发现,鱼藤素可以诱导p53上调的凋亡调节物介导的肺癌细胞凋亡并增强其对阿霉素的敏感性。ZHENG W等[13]研究表明,鱼藤素可以抑制人胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭,诱导细胞发生凋亡。LI W等[14]研究显示,鱼藤素通过下调B细胞特异性小鼠白血病病毒插入位点1基因的表达,抑制体内和体外非小细胞肺癌细胞的生长。本研究选取处于对数生长期的小鼠神经母细胞瘤细胞Neuro-2A,经鱼藤素处理后发现,细胞存活率降低、凋亡率升高、细胞增殖标志蛋白Ki67的表达下调、cleaved-caspase3蛋白的表达上调,提示鱼藤素可以抑制小鼠神经母细胞瘤细胞增殖,诱导其发生凋亡。

TLR亚型TLR4是一种重要的模式识别受体,可以识别病原相关分子模式并与其他辅助受体结合形成复合物传递信号,经过系列信号级联反应使核因子κB抑制剂激酶活化,降解核因子κBα,并释放转录因子NF-κB,由细胞质转位至细胞核,刺激下游信号分子的表达[15]。NF-κB与炎症因子、细胞增殖、细胞凋亡以及细胞外基质交联密切相关,参与多种信号的转导,NF-κB p65、NF-κB p50是其常见的作用形式[16-17]。FEI W等[18]研究显示,板栗壳提取物可通过调控TLR4/NF-κB途径抑制肝癌细胞增殖,减轻炎症反应。ZHOU W等[19]研究发现,半乳糖凝集素3可通过激活TLR4/NF-κB信号转导途径促进肺腺癌细胞增殖。此外,ZHANG R等[20]研究表明,穿心莲内酯可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路抑制人结肠癌细胞增殖,并诱导细胞凋亡。本研究结果显示,鱼藤素可下调Neuro-2A细胞TLR4基因的转录,下调TLR4、p-p65蛋白的表达,而TLR4/NF-κB通路激动剂LPS则表现相反的作用效果。用鱼藤素和激动剂同时处理Neuro-2A细胞后,激动剂对通路相关基因转录和蛋白表达的促进作用被逆转,表明鱼藤素可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路,调控增殖、凋亡相关基因的表达,抑制小鼠神经母细胞瘤细胞株Neuro-2A的增殖,诱导细胞凋亡。

综上所述,鱼藤素可以抑制Neuro-2A细胞的增殖,诱导其发生凋亡,可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路、调控细胞增殖、凋亡相关蛋白的表达有关,为鱼藤素相关药物的研发及应用于NB的临床治疗提供理论支持。