发酵清肺颗粒对免疫抑制小鼠免疫调节作用研究

刘雪松，张 艳，薛沾枚，苏 景，郝敬友，唐 伟，刘彦凯，孙洪杰，徐 丽，史同瑞*

(1.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔 161005；2. 黑龙江省兽用药物重点实验室，黑龙江齐齐哈尔 161005；3.黑龙江省动物疫病控制中心，黑龙江哈尔滨 150030；4.哈尔滨绿达生动物药业有限公司，黑龙江哈尔滨 150030)

清肺颗粒是由板蓝根、葶苈子、浙贝母、桔梗以及甘草组成的经典复方中兽药，被收录在《中华人民共和国兽药典》，具有清肺平喘、化痰止咳的功效[1]。清肺颗粒中富含多种中药有效成分，包括表告乙春、槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷以及甘草苷等。微生物发酵是一种传统的中药炮制方法，具有提高中药有效成分、产生新的活性成分、降低毒副作用、增强中药药效等优点。进行发酵的微生物种类繁多，这些微生物可以产生分解植物细胞壁致密结构成分的酶，如纤维素酶、半纤维素酶以及淀粉酶等，使植物的细胞壁结构变疏松，细胞间隙变大，释放更多的中药有效成分[2-3]。试验采用产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌，应用微生物发酵技术，优化了清肺颗粒组方的提取工艺以及制粒处方。对免疫抑制小鼠进行灌胃给药，通过检测体重变化、脾脏、胸腺指数、巨噬细胞吞噬能力、脾淋巴细胞增殖指数以及血清因子含量等，探究清肺颗粒对免疫抑制小鼠的免疫调节作用，为清肺颗粒的药理学研究提供相应理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材 清肺颗粒由板蓝根、葶苈子、浙贝母、桔梗以及甘草组成。发酵清肺颗粒是利用黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院微生物研究所分离得到的解淀粉芽孢杆菌，以2%的接菌剂量和30%中药粉、10%黄豆粉、0.2%CaCO3、59.8%水的比例进行发酵提取后制粒获得，发酵清肺颗粒由哈尔滨绿达生动物药业有限公司制备并经检验合格。

1.1.2 实验动物 Balb/c小鼠60只，8周龄，雌雄各半，购自齐齐哈尔医学院实验动物中心。

1.1.3 主要试剂 环磷酰胺，北京华迈科生物技术有限责任公司产品；RPMI-1640培养基，上海语纯生物科技有限公司产品；刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)和CCK-8，美国Sigma公司产品；IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α ELISA检测试剂盒，南京建成生物工程研究所产品。

1.1.4 主要仪器 分析天平(WT1003H)，常州万泰天平仪器有限公司产品；台式高速离心机(TG16B)，湖南凯达科学仪器有限公司产品；电热恒温培养箱(DH4000Ⅱ)、超净工作台(CJ-2S)，天津市泰斯特仪器有限公司产品；酶标仪(Elx808)，美国Bio-Tek公司产品；CO2培养箱(HF90)，上海力申科学仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分组 在试验开始前，小鼠适应试验环境1周。适应后，将小鼠随机分组，分别为正常组、模型组以及发酵清肺颗粒组(25、50、100 mg/kg)。根据相关参考文献，对模型组以及发酵清肺颗粒组进行环磷酰胺免疫抑制小鼠的建立[4-5]。第1天～第3天，腹腔注射环磷酰胺溶液，剂量为70 mg/kg。第5天，改为剂量为90 mg/kg。小鼠达到免疫抑制状态后，发酵清肺颗粒组连续灌胃给药7 d，每天1次。正常组和模型组灌胃无菌生理盐水。

1.2.2 体重检测 从灌胃发酵清肺颗粒开始，每天检测各组的小鼠体重，共检测5 d。

1.2.3 脾脏、胸腺指数测定 最后1次灌胃给药后，无菌取出小鼠完整的胸腺以及脾脏。用生理盐水洗尽血污后，用滤纸吸干水分。对胸腺以及脾脏称重，计算脾脏指数以及胸腺指数。计算公式如下：

脏器重量(mg)/体重(g)=脏器指数

1.2.4 巨噬细胞吞噬能力 根据相关参考文献，进行巨噬细胞吞噬能力的测定[6]。最后1次灌胃给药后，小鼠进行处死，用750 mL/L酒精浸泡消毒，在无菌条件下腹腔注射5 mL PBS，收集腹腔注射液，重复注射以及收集3次，合并收集液，1 500 r/min离心15 min，弃去上清液，加入Tris-NH4Cl 1 mL，室温下静置10 min，1 500 r/min 离心10 min，留沉淀细胞。重复此操作直至红细胞全部裂解。用RPMI-1640完全培养基重悬沉淀细胞，调整巨噬细胞密度达到2×106个/mL，活细胞数大于95%。在96孔板中，每孔加入100 μL巨噬细胞，在37 ℃、体积分数为5%的CO2条件下培养6 h，在每孔中加入100 μL 1 mg/mL的中性红溶液，继续培养30 min，弃去上清液，每孔用PBS重复冲洗3次，加入细胞裂解液100 μL，轻微摇晃，4 ℃条件下过夜。酶标仪测定492 nm处OD值，以OD值表示巨噬细胞吞噬能力。

1.2.5 脾淋巴细胞增殖测定 参考相应文献中的方法进行脾淋巴细胞悬液的制备及脾淋巴细胞增殖试验[7-8]。最后1次灌胃给药后，小鼠处死，无菌取出脾脏。无菌条件下，将脾脏研磨碎后放置于RPMI-1640不完全培养基中。过200目筛网，除去脂肪等杂质，得到匀浆液。3 000 r/min离心10 min，获得细胞沉淀，加入适量红细胞裂解液反应10 min，3 000 r/min离心10 min除去红细胞。得到的细胞沉淀用RPMI-1640不完全培养基洗涤数次。最后加入适量RPMI-1640完全培养基，进行细胞计数，活细胞数大于95%。48孔板中，试验孔加入50 μL脾细胞悬液，试验孔中再加入50 μL刀豆蛋白A或者脂多糖溶液溶液，使终浓度达到5 μg/mL。设置只含有脾细胞悬液的对照孔。以上试验结重复3次。将加完样的48孔板放置在37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养2 h，充分混匀后，在450 nm波长测定吸光度(OD)值。刺激指数为指标，评定小鼠脾脏淋巴细胞增殖程度，计算公式如下：

1.2.6 细胞因子含量测定 最后1次灌胃给药后，进行眼眶静脉丛采血。采血后，3 500 r/min条件下离心15 min，获得血清。采用ELISA试剂盒检测血清中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-4以及IL-10细胞因子含量。

1.2.7 Th1/Th2比值计算 IFN-γ和IL-4分别体现了Th1型和Th2型淋巴细胞的主要效应，这2种细胞因子经常作为监测Th1型和Th2型淋巴细胞免疫功能的指标。在测定完细胞因子含量后，根据IFN-γ与IL-4因子含量计算Th1/Th2比值。公式如下:

2 结果

2.1 发酵清肺颗粒对小鼠体重的影响

小鼠体重变化如表1所示。从表1可以看出，注射环磷酰胺对小鼠体重的影响较大，与正常组相比，模型组小鼠显著下降，下降了28%左右。给药组在不同程度上可以使注射环磷酰胺的减重效果减轻。相比较于模型组，不同剂量的给药组均显著提升了小鼠的体重。

表1 小鼠体重变化情况

2.2 脾脏、胸腺指数

脾脏指数以及胸腺指数分别如表2所示。从表2中可以看出，进行环磷酰胺腹腔注射的模型组小鼠脾脏指数和胸腺指数明显低于正常组。相比较于模型组来说，各个剂量的发酵清肺颗粒在一定程度上会增加小鼠的脾脏指数和胸腺指数。高剂量组的给药可以显著提升小鼠的指数，使指数接近到正常组的水平。

表2 小鼠胸腺、脾脏指数

2.3 巨噬细胞吞噬能力

中性红法测定巨噬细胞吞噬能力见表3。结果显示，与正常组对比，经过腹腔注射环磷酰胺后的小鼠巨噬细胞吞噬中性红的能力显著下降。各剂量发酵清肺颗粒的小鼠巨噬细胞对比模型组，其对中性红的吞噬能力都有所提升。其中高剂量发酵清肺颗粒组的吞噬能力较接近正常组水平。

表3 巨噬细胞吞噬能力

2.4 脾淋巴细胞增殖测定

脾淋巴细胞增殖试验结果如表4。接受环磷酰胺腹腔注射的小鼠脾淋巴细胞对于刀豆蛋白A以及脂多糖诱导的增殖反应受到了明显的抑制。低剂量发酵清肺颗粒组，没有显著提升刀豆蛋白A以及脂多糖诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力。中剂量组和高剂量组皆能够显著提升小鼠脾淋巴细胞增殖能力。

表4 小鼠脾淋巴细胞增殖能力

2.5 血清因子测定

血清中细胞因子含量测定结果如表5。与正常组相比较，IFN-γ、TNF-α、IL-2以及IL-6的含量在模型组小鼠中均明显下降，而IL-4和IL-10明显上升。与模型组相比较，对于IFN-γ、TNF-α、IL-2以及IL-6来说，给药组均能显著提升免疫小鼠血清中各细胞因子的含量。对于IL-4以及IL-10来说，给药组均能有效减少其细胞因子含量。

表5 血清样品中各因子的含量变化

2.6 Th1/Th2结果

Th1/Th2的值如表6所示。可以看出,模型组中Th1/Th2的比值明显下降，各个剂量的给药组相比较于模型组均有显著提升，提升效果与剂量大小呈正相关。

表6 Th1/Th2的比值

3 讨论

目前常用来建立免疫抑制小鼠模型的药物很多，包括环磷酰胺、地塞米松、放线菌素以及环孢菌素A等，其中最常使用环磷酰胺进行模型的建立。环磷酰胺是治疗恶性肿瘤的经典药物之一，具有广谱的抗癌作用，但与此同时也具有免疫抑制作用[9]。环磷酰胺可以用于乳腺癌、卵巢癌以及宫颈癌等癌症的治疗，也可作为免疫抑制剂用于自身免疫性疾病，包括全身性红斑狼疮、特发性血小板减少性紫癜以及多发性肉芽肿等的治疗，又可以用于减少器官移植时的免疫排斥反应[10-11]。李燕华等[12]的研究表明，单次大剂量和多次小剂量腹腔注射环磷酰胺溶液均可以成功建立免疫抑制模型。本次试验采用多次小剂量注射后，隔1 d以大剂量进行环磷酰胺腹腔注射来建立小鼠免疫抑制模型。通过胸腺指数、脾脏指数、巨噬细胞吞噬能力以及细胞因子含量，可以看出模型组相比较于正常组，模型组小鼠的免疫受到了显著抑制，达到了建立模型的目的。

脾脏和胸腺是非特异性免疫中的重要免疫器官，淋巴细胞在此分化、成熟并产生免疫反应。脾脏是机体最大的外周免疫器官，胸腺是机体的中枢免疫器官。免疫器官的发育状况直接影响免疫功能和抵抗疾病的能力。以往研究表明，对小鼠腹腔注射环磷酰胺，可使脾脏淋巴细胞总数急剧下降，从而导致小鼠的脾脏和胸腺重量显著下降[13]。在本次试验中，环磷酰胺介导的免疫抑制小鼠的胸腺指数与脾脏指数皆显著低于正常组。低、中、高给药组在不同程度上缓解了免疫抑制小鼠的胸腺指数和脾脏指数下降的趋势，显著提升了胸腺指数和脾脏指数。发酵清肺颗粒提高了脾脏淋巴细胞的数量，可能是造成脾脏和胸腺指数显著上升的原因之一[14]。巨噬细胞的吞噬作用以及脾淋巴细胞的增殖，在宿主抵抗微生物入侵和外部刺激的先天防御中起着至关重要的作用[15-16]。吞噬细胞是先天免疫应答的关键环节，对其吞噬能力的测定是评价细胞免疫功能的重要指标。对巨噬细胞吞噬作用的研究多采用中性红试验。对于脾脏淋巴细胞的增殖作用，多采用刀豆蛋白A以及脂多糖刺激试验，其中T淋巴细胞免疫通过刀豆蛋白刺激的细胞增殖检测，而B淋巴细胞免疫通过脂多糖诱导的细胞增殖检测[17]。本次试验中，无论是以刀豆蛋白A进行的T细胞刺激指数的测定，还是以脂多糖进行的B细胞刺激指数的测定，与正常组相比，模型组菌显著降低。而给药组在不同程度上提升了脾淋巴细胞的增殖，显著提升了免疫抑制小鼠的免疫能力。

根据T淋巴细胞表面CD分子的不同，可以将其分为CD4+和CD8+T淋巴细胞两种细胞群。又根据其分泌细胞因子功能的不同，可以将CD4+T淋巴细胞分为Th1和Th2两种类型。Th1细胞产生Th1细胞因子，其中包括IFN、TNF以及IL-2等，Th2细胞产生Th2细胞因子，包括了IL-4、IL-6以及IL-10等[18]。在正常情况下，机体中Th1/Th2细胞的比值会处于相对平衡的状态，如果机体发生了生理功能异常，这种平衡就会被打破，平衡将向一方偏移，这种现象被称为“Th1/Th2平衡漂移”，“Th1/Th2平衡漂移”现象的出现已经证实与疾病的发生密切相关[19]。本次试验中正常组小鼠的Th1/Th2比值与王永杰[8]报道的数值相似。模型组相比较于正常组，Th1/Th2比值显著降低。而给药组在不同程度上提升了Th1/Th2比值，将机体的细胞因子分泌情况向着正常方向发展。

发酵是中药经常使用的炮制方法之一，具有悠久的历史。近些年来，发酵中药对动物免疫调节作用的研究正在逐渐增多。顾艳丽等[20]对复方中药发酵液对肉鸡的免疫调节作用进行了研究，显示复方中药发酵液可以显著提升肉鸡的法氏囊指数。陈柯源等[21]进行了当归补血汤发酵产物对肉鸡免疫功能的影响，发现能提升肉鸡的法氏囊指数，并且显著提高IFN-γ、TNF-α、IL-2以及IL-6含量。通过本次试验可以看出，发酵清肺颗粒可以显著提升免疫抑制小鼠的免疫功能，使其免疫功能朝着正常的方向发展。