绵羊流产衣原体、立克次体与大肠埃希氏菌混合感染的实验室诊断

徐海玲，李梦磊，高 睿，许信刚，张 琪

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.杨凌职业技术学院动物工程分院，陕西杨凌 712100)

流产衣原体(Chlamydiaabortus)和Q热立克次体(Coxiellaburnetii)作为严格胞内寄生的革兰氏阴性微生物[1-2]，是一类在全世界流行范围比较广的人兽共患病病原，感染该病原不仅会降低动物的生产性能，同时也能使人类感染及发病[3-4]。引发羊地方性流产病(EAE)的主要病原为流产衣原体，能使山羊、绵羊、奶牛等多种动物感染，从而引发母畜流产和死胎，孕妇与患流产衣原体病的家畜直接接触也可感染导致流产[5]；Q热是由伯氏立克次体(Coxiellaburnetii)感染引起的广泛分布于全球的人兽共患病之一，动物感染Q热后没有明显的症状，可能引发流产、产死胎或弱胎[6]；羊致病性大肠杆菌病不分季节都可感染羊发病，感染率和病死率都比较高，主要症状为水样腹泻和败血症[7]。2021年6月，甘肃省某规模化奶绵羊养殖场发生一起母羊流产同时伴有腹泻病例导致3只母羊死亡。为确定流产及腹泻的病因并为治疗提供依据，无菌采集流产胎儿的肝脏、脾脏、胃和脐带以及母羊的肝脏组织等进行实验室检测，并经药敏试验筛选出的敏感药物对同群病羊进行治疗。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 甘肃省某规模化奶绵羊养殖场发生流产和腹泻的母羊，剖检并无菌采集腹泻母羊的肝脏、脾脏、肠内容物各3份以及流产胎儿的肝脏、脾脏、脐带和胃各4份。

1.1.2 培养基和试剂 细菌常用培养基、靛基质试剂等按文献[8]介绍的方法制备；药敏纸片、DNA标准DL 2 000、组织DNA提取试剂盒，睿时生物科技有限公司产品；细菌生化鉴定管，杭州滨河微生物试剂有限公司产品。

1.1.3 仪器设备 PCR仪(K960)，力康生物医疗科技有限公司产品；琼脂糖电泳仪(DYCP-31DHDYY-6C)，北京六一生物科技有限公司产品；超净工作台(SW-CJ-2F)，苏州安泰空气技术有限公司产品；立式压力蒸汽灭菌锅(XFS-280A)，浙江新丰医疗器械有限公司产品；凝胶成像分析系统(GenoSens 1800)，北京赛智创业科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 参考文献[9-10]针对羊流产衣原体和羊立克次体设计特异性引物：流产衣原体特异性扩增引物为F：5'-CCCCAAGCCAGCATCTAATA-3'，R：5'-TTAGAGCCCAGGCAGTCTCG-3'，扩增产物大小为523 bp；立克次体引物序列为F：5'-TATGTATCCACCGTAGCCAGT-3'，R：5'-CCCAACAACACCTCCTTATTC-3'，扩增产物大小为687 bp，引物交由西安热默尔生物公司合成。

1.2.2 DNA提取与PCR鉴定 胃内容物、脐带研磨处理后，提取总基因组，以获得的总基因组为模板，采用表1的引物参考文献[9-10]进行RCR扩增。PCR产物送至迈浦生物科技有限公司测序，结果在NCBI上Blast比对。

1.2.3 细菌的分离 无菌取肝脏、肺脏深部组织分为两部分，将一部分肝脏及肺脏组织参考文献[8]进行有氧培养12 h后取培养的菌液划线接种于麦康凯培养基上，37 ℃培养12 h。挑取边界清晰的单一菌落进行革兰氏染色镜检观察；另外一部分肝脏及肺脏组织参考文献[8]进行厌氧培养后12 h后染色镜检观察。

1.2.4 细菌生化试验 将有氧培养分离菌株的纯培养物接种到细菌生化鉴定管中37 ℃ 24 h后观察结果。

1.2.5 药敏试验 按文献[8]介绍的K-B法操作及判定。

1.2.6 小鼠致病性试验 挑取健康清洁级小鼠10只，随机分为A、B两组，每组5只，A组作为试验组在腹腔注射分离菌液0.2 mL/只(1×108CFU/mL)，B组作为对照组在腹腔注射0.2 mL/只的无菌生理盐水。及时观察小鼠的健康状况，对试验组死亡小鼠及时解剖并制作肝、脾组织的涂片染色之后进行镜检。

2 结果

2.1 PCR鉴定结果

PCR鉴定结果显示，4份胃内容物及脐带样品流产衣原体鉴定均扩增出523 bp的条带(图1)；4份胃内容物及脐带样品立克次体鉴定均扩增出687 bp的条带(图2)。扩增出的流产衣原体测序结果(图3)通过NCBI Blast比较分析和流产嗜性衣原体同源性为100%；扩增出的立克次体测序结果(图4)通过NCBI Blast比较分析与伯氏立克次体同源性为100%。因此，4份样品被鉴定为流产衣原体和立克次体共同感染。

M.DNA 标准DL 2 000;1～4.被检测样品；5.阴性对照

M.DNA 标准DL 2 000;1～4.被检测样品；5.阴性对照

图3 扩增的流产衣原体测序结果

图4 扩增的立克次体测序结果

2.2 细菌分离培养及革兰氏染色结果

在麦康凯培养基上形成肉眼可见的圆形、边缘整齐、表面光滑，菌落中心部分呈现深红色的单个菌落(图5)，挑取单个菌落进行革兰氏染色后可在镜下观察到粉红色、形态呈短杆状、两端圆滑的杆菌(图6)。符合大肠埃希氏菌的特性。厌氧培养基未见细菌生长。

图5 麦康凯培养基菌落形态

图6 染色镜检结果(1 000×)

2.3 生化试验结果

按照文献[11]的标准进行该分离株的生化试验鉴定，结果见表1，该分离株的生化特性与大肠埃希氏菌相符，因此，确定分离菌株为大肠埃希氏菌。

表1 分离株生化试验

2.4 小鼠致病性试验结果

试验组小鼠感染后8 h出现精神萎靡，被毛粗乱等症状，在12 h全部死亡，对照小鼠无异常。剖检试验组死亡小鼠从肝脏分离出大肠埃希氏菌。

2.5 药敏试验结果

用13种常用药敏纸片对分离出的大肠埃希氏菌进行药敏试验，结果如表2。

表2 13种药敏纸片对分离株药敏试验

3 讨论

引起绵羊流产的原因很繁杂，疫病性因素主要包括如弓形虫病、新孢子虫病、衣原体病、Q热以及蓝舌病等；非疫病性因素如损伤及管理造成的流产、药物不合理使用造成的流产以及应激反应造成的流产等[12-13]。Q热和流产衣原体病作为引发流产的最主要病原，呈全球分布态势。流产衣原体常呈地方性流行，羊只被衣原体感染后一般情况下不会发病，但是会导致怀孕母羊的流产以及产弱羔，我国某些地区绵羊流产衣原体病阳性率高达47%[14]。动物感染Q热病原后大多没有明显的发病症状，但会引发怀孕母羊流产、产死胎或弱胎，公羊不育等繁殖障碍问题。由于Q热在我国动物疫病监测体系中是被忽视的一类传染病，日常监测和早期诊断技术不足，导致Q热在我国部分地区广泛流行，阳性率在2.63%～35.56%之间[15]。2021年6月，甘肃省某规模化奶绵羊养殖场发生一起母羊流产同时伴有腹泻病例导致3只母羊死亡。为确定流产的原因，通过无菌采集流产胎儿的肝脏、脾脏、胃和脐带等进行PCR检测。结果显示本次研究检测中的4份胎儿胃内容物、脐带全部为Q热和流产衣原体双重感染。该病例表明引起绵羊流产的病原不再是某一个病原单一的感染，混合感染将是未来的主要存在方式，这种现象给控制绵羊相关疾病带来了困难。

进一步对无菌采集腹泻母羊肝脏进行细菌分离鉴定，确定引起腹泻的病原为大肠埃希氏菌，经小鼠致病性试验和药物敏感性试验可知，分离出来的大肠埃希氏菌具有较强的致病性和耐药性，确定引起羊只死亡的病原为大肠埃希氏菌，该分离菌只对头孢噻肟、诺氟沙星、左氟沙星敏感，对其他临床常用药物都表现不敏感。使用头孢噻肟肌肉注射进行治疗，羊群腹泻现象明显改善。对于羊的腹泻，兽医临床治疗上都运用抗菌药物，由于临床治疗中不规范使用抗菌药物导致大肠埃希氏菌耐药性的发生越来越频繁，将给兽医临床治疗和公共卫生以及养殖业本身都带来不利的影响[17]。在养羊场中，当需要药物治疗疾病时，必须首先针对性治疗病原体。实验室确诊后，再进行药物敏感性试验选择高效药物，避免该流行病扩散以及耐药性的产生。

本次研究的意义在于为预防临床上发生类似的Q热立克次体、流产衣原体和大肠埃希氏菌混合感染提供数据参考，在临床上除了加强对羊群的防疫外，还要提高饲养和管理水平，及时清扫环境卫生，以减少此类混合感染的发生，一旦发生此类混合感染的疾病，要及时发现并治疗，同时也为制定抗菌药物的合理使用提供依据。