猪伪狂犬病病毒诱导猪肺泡巨噬细胞氧化应激和炎症反应研究

于美玲，缪卫媛，吴苑滢，梁 颖，曹迷霞，韦英益*，王 蕾，胡庭俊*

(广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005；2.南宁市食品药品检验所，广西南宁 530005)

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)隶属疱疹病毒科、疱疹病毒属，双股DNA病毒；PRV可以感染各个年龄段的猪，导致猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)，临床表现为呼吸困难、发热、腹泻、角弓反张、共济失调、繁殖障碍和呼吸系统疾病[1]。猪伪狂犬病传播速度快、途径多、范围广，是危害全球50多个国家和地区养猪业的重要传染病之一[2]。尽管在许多发达国家PRV已经得到净化，但2011年底，猪伪狂犬病在中国15个省份暴发，疫苗免疫接种的猪群感染强毒力PRV变异株，感染的新生仔猪病死率高达50%以上[3-4]。并且PRV可引起免疫缺陷，与日本脑炎病毒、沙门氏菌和大肠埃希氏菌等混合感染给养猪业造成巨大的经济损失[5-6]。另外，PRV对许多哺乳动物均有致病性，如山羊、犬、兔子、大鼠、水貂等，研究表明PRV对人具有潜在致病性[7-9]。因此，急需明确PRV感染机制和研发有效疫苗和药物。

PRV感染宿主后，首先在宿主的呼吸道和扁桃体上增殖，病毒可以经由血液到达全身各个组织器官，导致肺炎、肺组织坏死、胃肠炎和脑炎等全身组织器官炎症坏死[10-11]，诱导免疫细胞死亡[12]，引发免疫系统紊乱。肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage，AM)是宿主免疫系统中重要的免疫细胞[13]，具有吞噬和免疫调节功能，是病原微生物入侵肺部的第一道防线。而且AM是重要的炎性细胞之一，病原感染后产生大量活性氧，产生大量炎性因子，发动和延长细胞炎症反应，修复组织损伤，对维持肺的正常结构和功能起到核心的作用[14]。因此，研究PRV对猪肺泡巨噬细胞的免疫调节的影响，对揭示PRV感染宿主的致病机制具有重要意义。

为了探究PRV体外感染免疫细胞是否引起氧化应激和炎性反应，以及如何影响机体免疫调节，本试验通过用PRV体外感染猪肺泡巨噬细胞系3D4/2细胞，探讨PRV感染剂量与感染时间对3D4/2细胞中白细胞介素1β(interleukin 1 beta，IL-1β)、IL-6、IL-8、IL-10、肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、γ干扰素 (interferon gamma，IFN-γ)、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)和一氧化氮(nitric oxide，NO)炎性因子含量及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、黄嘌呤氧化酶D(xanthine oxidase D，XOD)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、环氧合酶-1(cyclooxygenase-1，COX-1)和COX-2酶活性的影响，建立PRV感染免疫细胞的体外氧化应激和炎症模型，为进一步对PRV感染致病机制的研究和防控PRV感染药物开发奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和细胞系 PRV-GXLB-2013株，广西大学动物科学技术学院预防兽医学教研室提供；猪肾脏细胞(porcine kidney，PK-15)细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，由广西大学动物科学技术学院兽医药理实验室保存提供；3D4/2细胞是猪肺泡巨噬细胞，由广西大学动物科学技术学院兽医药理实验室冻存。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养液，美国GIBCO公司产品；胎牛血清，维森特生物技术有限公司产品；0.5 mg/mL胰蛋白酶、L-谷氨酰胺，索莱宝科技有限公司产品；Universal Genomic DNA Kit，康为世纪生物科技有限公司产品；2×master mix PCR酶，罗氏公司产品；NO、GSH、XOD、iNOS、MPO和ROS试剂盒(生产批号20171221)，南京建成生物工程研究所有限公司产品；IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、COX-1和COX-2 ELISA试剂盒(生产批号20171229)，江苏晶美生物科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 二氧化碳细胞培养箱(C150)，德国BINDER公司产品；倒置显微镜(TS100-F)，日本Nikon公司产品；多功能荧光酶标仪(TECAN)，美国Perkin Elmer公司产品；紫外可见光分光光度计(UV1750型)，日本岛津公司产品；梯度PCR仪(S1000)、全自动凝胶成像系统(Gel DocTMXR+)，美国Bio-Rad公司产品；琼脂糖凝胶电泳仪(DYY-8C)，北京六一生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 PRV病毒毒价的测定 将浓度为1×105cells/mL的PK-15细胞悬液铺于96孔细胞培养板上，每孔100 μL，细胞置于体积分数为5%的CO2培养箱中，37 ℃培养12 h后弃去上清液，PBS洗涤3次，利用无血清DMEM将病毒液作10倍梯度稀释(100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10)， 每孔加上述病毒稀释液100 μL，空白对照组加入等量DMEM，每组设置6个重复。细胞板置于体积分数为5%的CCO2培养箱中，37 ℃孵育2 h后弃去病毒液，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)洗涤3次，每孔加200 μL含50 mL/L胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM细胞维持液，置体积分数为5%的CCO2培养箱内37 ℃培养。每天在倒置显微镜下观察细胞并记录细胞病变(cytopathic effect，CPE)出现孔数，试验以最高稀释度病毒感染孔不再出现CPE为止，所得数据按Reed-Muench法计算TCID50。

1.2.2 PRV感染3D4/2细胞试验 按照感染复数(multiplicity of infection，MOI)=11.1将PRV病毒液接入3D4/2细胞，放置于体积分数为5%的CO2恒温培养箱中37 ℃培养2 h，期间每隔30 min轻轻摇晃一下细胞瓶；弃去病毒液，用无菌0.01 mmol/L PBS洗涤细胞3次；加入5 mL 50 mL/L-FBS-DMEM培养基，细胞置于体积分数为5%的CO2恒温培养箱中37 ℃继续培养24 h，观察细胞病变(CPE)。分别于感染后0、4、6、8、12、24、48 h分别收集细胞上清，按照Universal Genomic DNA Kit说明书提取病毒DNA。利用特异性引物扩增PRV gE基因(上游引物序列：5′-CGGCTTCCACTCGCAGCTCTTCTC-3′，下游引物序列：5′-TGTGGGTCATCACGAGCACGTACAGC-3′)，扩增体系及程序参照PCR酶说明书。将5 μL PCR产物经1 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。参照华涛等[15]建立的PRV荧光定量PCR检测方法，使用荧光定量PCR扩增PRV gB基因，检测PRV在3D4/2细胞上的增殖情况。荧光定量PCR上游引物序列：5′-GTCACCCGCGTGCTGATCGTCT-3′，下游引物序列：5′-GGCAACCACCGGCGCTACTTT-3′。

1.2.3 PRV感染3D4/2细胞存活率的测定 将2×105cells/mL 3D4/2细胞接种于96孔板培养后，将PRV按照MOI=0.000 111、0.001 11、0.011 1、0.111、1.11、11.1、111和1 110等8种不同的剂量进行接毒，培养48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，放置于细胞培养箱内继续孵育1 h，酶标仪检测450 nm 吸光度(OD 450 nm)。细胞对照组为含细胞、培养基和CCK-8溶液，空白对照组为不含细胞、含培养基和CCK-8溶液。细胞活力(%)=(OD试验组-OD空白对照组)/(OD细胞对照组-OD空白对照组)×100。

1.2.4 样品的采集 将3D4/2细胞加入24孔板，每孔1 mL。培养过夜后弃去原培养液，用PBS洗2次～3次，细胞对照组加入20 mL/L FBS-DMEM培养液200 μL，试验组加入200 μL不同浓度PRV病毒液(MOI=0.000 111～1.11)。细胞培养板置于体积分数为5%的CO2培养箱中37 ℃吸附2 h，期间每20 min摇晃1次，弃去病毒液，PBS清洗2次～3次后每孔加入1 mL含20 mL/L FBS-DMEM培养液后继续培养。细胞培养4、8、12、24、48 h后，分别收集上清液和刮取细胞，用于相关指标的测定。

1.2.5 PRV感染3D4/2细胞ROS和NO水平的测定 取上清液，按照一氧化氮(NO)试剂盒说明书测定NO水平；按照活性氧(ROS)试剂盒说明书测定ROS水平。

1.2.6 PRV感染3D4/2细胞内XOD、MPO、iNOS和GSH水平的测定 将刮取的细胞冰水浴超声破碎3 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液按照试剂盒说明书测定XOD、MPO、iNOS和GSH的水平。

1.2.7 PRV感染后3D4/2细胞上清液中COX-1和COX-2酶活性的测定 取细胞上清液，按照试剂盒说明书操作，测定COX-1和COX-2的酶活性。

1.2.8 PRV感染后3D4/2细胞上清液中细胞因子水平的测定 取细胞上清液，按照试剂盒说明书操作，测定IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ和MCP-1的含量。

1.2.9 数据分析 试验数据采用SPSS 21.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行差异性检验，用LSD法进行多重比较。其中P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 病毒感染3D4/2结果

PRV在PK-15细胞上增殖后，按照Reed-Muench方法测定PRV扩增病毒液的TCID50是1×10-7.5/0.1 mL。PRV感染3D4/2细胞后陆续出现细胞病变(CPE)(图1)，CPE主要表现：接毒后24 h细胞出现变圆、皱缩、发亮，破碎，逐渐拉网并脱落，呈现疱疹病毒特有的病变。PRV感染细胞6、12、24、48 h后经PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果均可在388 bp处出现一条与预期大小一致的条带(图2)，且条带亮度随病毒感染时间增加而增亮。荧光定量PCR检测结果表明PRV感染3D4/2细胞后，0 h～8 h 病毒快速增殖，24 h和48 h病毒含量较大，与常规PCR检测结果相符(图3)。说明PRV能够感染3D4/2细胞，并可在3D4/2细胞上增殖。

A.3D4/2细胞对照(40×)；B.PRV感染3D4/2 24 h(40×)

1.PRV阳性对照；M.DL 2 000 Marker；2.细胞对照；3～6.PRV感染后6 h～48 h；7.阴性对照

图3 PRV在3D4/2细胞上增殖结果

2.2 PRV感染对3D4/2细胞存活率的影响

由图4可知，与细胞对照组相比，当MOI=111和1 110时，PRV感染3D4/2细胞48 h后极显著抑制了细胞的活性(P<0.01)；MOI=11.1时显著抑制了细胞活性(P<0.05)；其他剂量的PRV感染3D4/2细胞对细胞活性无影响(P>0.05)。

图4 PRV感染对3D4/2细胞活性的影响

2.3 PRV感染对3D4/2细胞ROS和NO水平的影响

由图5可知，与细胞对照组相比，按照MOI=1.11接毒PRV 8、12、24 h后细胞内ROS水平显著升高，NO水平于8 h和12 h显著升高(P<0.05)；按MOI=0.111接毒PRV 24 h和48 h后细胞内ROS水平显著升高，NO水平于4、8、24 h显著升高(P<0.05)；按MOI=0.011 1接毒PRV 8 h和48 h后，细胞内ROS和NO水平显著升高(P<0.05)；按MOI=0.001 11接毒48 h细胞内ROS水平显著升高，NO水平于4 h、24 h和48 h显著升高(P<0.05)；按MOI=0.000 111接毒8 h细胞内ROS水平显著升高，NO水平于4、8、12、24、48 h显著升高(P<0.05)。

图5 PRV感染3D4/2细胞对ROS和NO产生的影响

2.4 PRV感染3D4/2细胞对细胞内XOD、MPO、iNOS和GSH水平的影响

由图6可知，与细胞对照组相比，按MOI=1.11接毒PRV 4、8、12、24、48 h后细胞内XOD活性显著升高，MPO活性于48 h显著升高，GSH水平于4、12、24、48 h显著降低(P<0.05)；按MOI=0.111和MOI=0.011 1接毒8 h和12 h后细胞内XOD活性显著升高，NOS活性于4 h、8 h和24 h显著升高，GSH水平于4 h、8 h、12 h和24 h显著降低(P<0.05)；按MOI=0.001 11接毒PRV 12 h和24 h后细胞内XOD活性显著升高，MPO活性于12 h显著升高，iNOS活性于4、8、24、48 h显著升高，GSH水平于8 h和12 h显著降低(P<0.05)；按MOI=0.000 111接毒PRV 8、12、24、48 h后细胞内XOD活性显著升高，MPO活性于12 h显著升高，iNOS活性于4、8、24 h显著升高，GSH水平于4、8、12 h显著降低(P<0.05)。

图6 PRV感染3D4/2细胞对细胞内XOD、MPO、iNOS活性和GSH水平的影响

2.5 PRV感染3D4/2细胞对细胞分泌COX-1和COX-2酶活性的影响

与细胞对照组相比，按MOI=1.11接毒PRV 12 h和48 h后细胞内COX-1活性显著升高，COX-2活性于24 h显著升高(P<0.05)；按MOI=0.111接毒4 h、8 h和12 h后细胞内COX-1活性极显著升高(P<0.01)，COX-2活性于24 h和48 h显著升高(P<0.05)；按MOI=0.011 1接毒PRV 4 h和12 h后细胞内COX-1和COX-2活性极显著升高(P<0.01)；按MOI=0.001 11接毒PRV 4 h和12 h后细胞内COX-1活性极显著升高(P<0.01)；按MOI=0.000 111接毒PRV 4 h和12 h后细胞内COX-1活性显著升高(P<0.05)，COX-2活性于48 h极显著升高(P<0.01)(图7)。

图7 PRV感染3D4/2细胞对COX-1和COX-2酶活性的影响

2.6 PRV感染3D4/2细胞对细胞上清液中炎性因子水平的影响

与细胞对照组相比，按MOI=1.11接毒PRV 48 h后细胞内IL-6和IL-8含量显著升高，IL-10含量于4 h和24 h显著升高，IFN-γ含量于4 h和12 h显著升高，MCP-1含量于12 h和48 h显著升高(P<0.05)，TNF-α含量于8、24、48 h显著升高(P<0.05)；按MOI=0.111接毒PRV 4、12、48 h后细胞内IL-1β含量显著升高，IL-6含量于8、24、48 h显著升高，IL-8含量于24 h极显著升高，IL-10和IFN-γ含量于8 h和24 h显著升高，MCP-1含量于8、12、48 h显著升高，TNF-α含量于4、8、12、24、48 h显著升高(P<0.05)；按MOI=0.011 1接毒PRV 8 h后细胞内IL-6和IFN-γ含量显著升高，IL-8含量于24 h极显著升高，IL-10含量于8 h和24 h极显著升高，MCP-1含量于8、12、24 h极显著升高(P<0.01)，TNF-α含量于4、12、48 h显著升高(P<0.05)；按MOI=0.001 11接毒PRV 4、12、48 h后细胞内IL-6含量显著升高(P<0.05)，IL-8和MCP-1含量于48 h极显著升高(P<0.01)，IL-10含量于4、8、24、48 h显著升高，IFN-γ含量于8、12、48 h显著升高，TNF-α含量于8 h显著升高(P<0.05)；按MOI=0.000 111接毒PRV 48 h后细胞内IL-1β和IL-8含量极显著升高(P<0.01)，IL-6含量于4 h和48 h显著升高，IL-10含量于8、24、48 h显著升高，IFN-γ含量于12 h显著升高，MCP-1含量于4、12、48 h显著升高，TNF-α含量于24 h和48 h显著升高(P<0.05)(图8)。

图8 PRV感染3D4/2对细胞内IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、MCP-1和TNF-α的含量的影响

3 讨论

肺泡巨噬细胞是下呼吸道的第一道防线，在机体的先天免疫和获得性免疫中有很重要的作用，能够吞噬细菌或病毒等侵袭物[14]。3D4/2细胞是猪肺泡巨噬细胞(PAM)的体外传代细胞系，虽然该细胞的吞噬功能已经丧失，但保留着细胞因子分泌的功能，且其对许多猪病毒都易感，可应用于研究病毒感染诱导细胞炎症反应的机制[13]。PRV是泛嗜性病毒，可以在许多细胞比如PK-15、Vero、ST等内复制，并且可产生明显的细胞病变(CPE)及出现核内嗜酸性包涵体[16]。本研究中将PRV接毒于3D4/2细胞，细胞产生明显的CPE，同时PRV感染对细胞的生长有很强的抑制作用，进一步证实了该3D4/2细胞的病变与PRV感染有直接的关系；采用PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示，PRV特异性扩增条带随感染时间延长而变亮，荧光定量PCR结果进一步证明PRV可感染3D4/2细胞，并可在3D4/2细胞上增殖。研究结果与Weingartl H M等[13]报道的3D4/2可支持PRV的复制相符。

PRV感染宿主后，常导致生殖系统炎症、肺炎、胃肠炎和脑炎等全身组织器官炎症坏死[10-11]。炎症是机体对致炎因素的局部损伤而产生的具有一定防御意义的应答性反应，是发病学的基础[17]。建立PRV感染细胞炎症模型对研究PRV感染机制及研发抗PRV感染药物意义重大。有学者利用LPS刺激巨噬细胞来模拟体内炎症反应，通过建立人的子宫内膜细胞体外炎症模型研究子宫内膜炎症、出血和修复机制[18-19]。本研究利用PRV刺激猪肺泡巨噬细胞，分析PRV感染对3D4/2细胞活性影响，检测不同时间段胞内炎症介质的变化规律，模拟PRV感染体内炎症反应。结果表明高剂量PRV可显著抑制细胞活性，所以本研究选定后续试验MOI分别是0.000 111、0.001 11、0.011 1、0.111和1.11，不同剂量PRV感染3D4/2细胞4 h ～48 h能够显著或极显著升高IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、NO和ROS炎性因子水平及COX-1、COX-2、XOD、MPO和iNOS酶活性，极显著下调细胞内GSH含量水平。

ROS、NO、iNOS、XOD和GSH水平是细胞的氧化还原状态直接指标[20-21]。病毒感染时，激活的巨噬细胞通过呼吸爆发，产生大量ROS和NO，引起脂质过氧化和抗氧化体系失调[20]，直接或间接影响酶活性，损伤DNA和蛋白质，造成细胞损伤[22-23]。本研究中不同剂量PRV感染3D4/2细胞可引起ROS和NO水平极显著升高，感染早期(4 h)细胞ROS水平没有显著变化，当MOI=1.11时在感染中期(8、12、24 h)引起细胞ROS水平升高，随感染时间延长(48 h时)，按MOI=0.111、0.011 1和0.001 11接毒PRV可引起细胞内产生过量ROS，且ROS水平极显著高于对照组。与ROS变化不同，NO水平在感染早期即显著升高，低剂量PRV感染48 h内可持续性引起细胞内NO水平显著升高。PRV感染后，巨噬细胞产生ROS和NO以抗病毒感染，调节下游效应因子，发挥非特异性免疫应答反应。高剂量病毒在感染早、中期即可引起自由基水平显著升高，在晚期损伤细胞，出现明显病变(图1)，自由基水平下降；iNOS主要存在于巨噬细胞等免疫细胞中，可以诱导产生大量的NO，与NO变化趋势一致，PRV感染细胞早期可极显著升高细胞iNOS活力，按MOI=0.111接毒PRV 24 h细胞iNOS活力最高，分析与此时病毒含量较高，引起机体应答反应也较强烈，上调的细胞因子诱导iNOS大量合成。XOD可催化发生氧化还原反应可以使机体产生大量自由基而损伤细胞[24]，与ROS变化趋势相似，低剂量PRV感染早期XOD活性无显著变化，按MOI=0.111接毒PRV 8 h和12 h极显著升高细胞的XOD活力，按MOI=1.11接毒PRV可持续性引起细胞XOD活力升高；MPO是过氧化物酶类，可以催化H2O2和Cl-产生HOCl，调节机体内过氧化物的含量[21]，中、低剂量PRV感染细胞12 h极显著升高细胞内MPO活性，从而可以减少细胞中自由基，降低相关酶活性，这与我们发现的除MOI=1.11时，iNOS、NO和ROS水平在感染12 h无显著变化的结果相符；GSH是体内重要的还原物质，对维持机体氧化还原平衡意义重大[21]，不同剂量PRV感染细胞均显著下调细胞内GSH水平，感染早期下调尤为明显，而按MOI=0.111接毒PRV 48 h内可持续性极显著下调细胞内GSH水平，引起细胞氧化还原状态失衡。综上分析，PRV感染后，细胞中iNOS酶活性首先升高，诱导产生NO；XOD酶活性后续升高，诱导产生大量ROS，消耗大量GSH；感染12 h时，机体代偿产生大量MPO平衡机体氧化还原稳态，所以中、低剂量PRV感染后期GSH含量恢复正常，而接毒剂量相对较大时GSH含量仍极显著降低，以上结果表明不同剂量PRV感染3D4/2细胞4 h～48 h能够改变3D4/2细胞的氧化还原状态。

细胞的氧化还原状态与炎症反应息息相关，ROS可以激活巨噬细胞在内的多种免疫细胞致使细胞分泌大量细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、COX-2和iNOS等，从而引起全身性炎症反应[25-27]。而细胞因子TNF又可以诱导细胞分泌H2O2[27]，IFN-γ能够诱导NO2-和H2O2释放， IL-1β和TNF-α也能诱导巨噬细胞提高O2-的分泌表达[28]。研究显示TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1、AP-1等很多因子的表达均能诱导细胞产生iNOS，进而生产NO[29-30]。自由基可以诱发促炎细胞因子的基因表达，反过来促炎细胞因子也可以诱导自由基的产生，二者之间形成一个正反馈循环[31]。本研究中不同剂量的PRV感染后，细胞内IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、COX-1和COX-2含量均有不同程度升高，细胞因子水平变化趋势与细胞内自由基水平变化趋势相符。COX-1、IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1含量在PRV感染4 h时即显著升高，COX-1在发生炎症时会快速分泌促炎细胞因子IL-6、TNF-α等参与炎症调节反应过程[32]；IL-1β、IL-6、TNF-α均可以促进炎症反应[33]，MCP是炎症趋化因子，以上因子水平的升高说明PRV感染早期即可诱导机体产生炎症反应。按MOI=0.111接毒PRV 48 h内可持续性显著升高细胞内TNF-α水平，MCP含量在PRV感染4 h～12 h 内呈上升趋势，引起细胞炎症反应明显。IL-8和COX-2主要是在PRV感染后期表现为显著升高。IL-8可引起呼吸爆发[34]，所以可引起ROS水平在感染24 h和48 h极显著升高，加重炎症反应；COX-2是诱导型环加氧酶，PRV感染后炎症细胞因子(如TNF-α、IL-1、IL-6、 COX-1等)、生长因子、LPS等刺激物能刺激细胞表达COX-2[35]，参与炎症反应。虽然促炎细胞因子在抗病毒先天免疫和适应性免疫应答是必不可少的[36]。但病毒感染期间，某些细胞因子的过量产生(又称细胞因子风暴)可损伤细胞和组织器官，引起疾病临床症状的表现等[37-38]。本研究中高剂量PRV感染3D4/2细胞(MOI=1.11) 4 h时，中剂量PRV感染3D4/2细胞(MOI=0.111、0.011 1和0.001 11)8 h时，细胞产生IFN-γ增多以抵抗感染，而随感染剂量和时间的增加，细胞抗病毒反应减弱，说明细胞抗损伤能力减弱；IL-10可以抑制炎症反应[39]，在感染4 h和8 h时，细胞IL-10水平升高，调节炎症反应，但感染48 h时仅低剂量组(MOI=0.000 111)显著升高，分析细胞已损伤，炎症反应调节能力下降。高剂量和长时间PRV感染易导致细胞炎性损伤，影响细胞因子分泌；同时由于各种炎性因子之间也存在着促进和抑制的作用，细胞因子变化比较复杂，所以本研究中细胞因子变化未表现剂量或时间依赖关系。综合分析，按MOI=0.111接毒PRV感染3D4/2细胞可于不同时间点能够显著或极显著升高IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、NO和ROS炎性因子水平及COX-1、COX-2、XOD、MPO和iNOS酶活性，极显著下调细胞内GSH含量水平，引起细胞氧化还原状态失衡，诱导细胞炎症反应。

综上所述，本研究采用了PRV成功诱导了3D4/2细胞发生了氧化炎症反应，并确定了将PRV按照MOI=0.111体外感染3D4/2细胞8 h～48 h是建立3D4/2细胞炎症模型的最佳条件。该模型能够用于进一步研究PRV感染与3D4/2细胞之间存在的相关炎症反应过程，为PRV体外感染研究提供数据支持。