金花三叶降糖颗粒的薄层色谱鉴别与含量测定*

庞宇舟，罗佳静，李芳婵,2Δ，陈 清，庞晓云，付吉利,2，王苏妃,2，梁资就,2

（1.广西中医药大学广西壮瑶药工程技术研究中心，南宁 530200；2.广西中医药大学广西高校中药提取纯化与质量分析重点实验室，南宁 530200；3.广西中医药大学制药厂，南宁 530299）

金花三叶降糖颗粒是根据“药食同源”及传统“食疗”文化理论总结挖掘的，是具有降糖功效的壮药保健产品。金花三叶降糖颗粒由金花茶叶、藤茶、荷叶、桑叶等传统药食两用的壮族特色药组方，从壮医角度分析，方中金花茶叶为主药，有清热毒、除湿毒、利水道之功；桑叶能祛风毒，清热毒；木姜叶柯能清热利尿，滋润肝肾；荷叶能清热毒，利水道；藤茶能清热毒，祛湿毒，通龙路，与“三叶”合用，共为帮药，主帮配伍，可清湿、热之毒，通龙路，调水道，针对糖尿病患者起到“未病先防，既病防变”的作用。前期研究表明，金花三叶降糖方能显著降低链脲佐菌素致高血糖模型小鼠的空腹血糖，并改善耐糖量。目前金花三叶降糖颗粒尚无相关的质量标准。本研究采用薄层色谱法（TLC）鉴别金花三叶降糖颗粒的藤茶、荷叶、木姜叶柯，采用高效液相色谱法（HPLC）测定金花三叶降糖颗粒中二氢杨梅素、杨梅素、根皮苷的含量，为金花三叶降糖颗粒的质量控制提供科学依据。

1 实验材料

1.1 仪器

Agilent1260Ⅱ高效液相色谱仪；Cary8453 紫外可见分光光度计；WFH-203B 型暗箱式自动紫外分析仪（昆山市顺诺仪器有限公司）；KQ500DA 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ME204型分析天平（梅特勒—托利多仪器有限公司）。

1.2 药材与试剂

荷叶对照药材（批号：121322201504，中国食品药品检定研究院）；二氢杨梅素（批号：MUST-19031501，成都曼思特有限公司）；荷叶碱（上海融禾科技发展有限公司）；杨梅素（批号：MUST-19022504，成都曼思特有限公司）；金花三叶降糖颗粒（批号：20190801、20190802、20190901、20190902、201901002、20191003，均由广西中医药大学提供）；硅胶GF254板（批号：080107，青岛海洋化工厂）；甲醇（批号：187159，赛默飞世尔科技有限公司，色谱纯）；乙腈（批号：182886，赛默飞世尔科技有限公司，色谱纯）；乙酸乙酯（批号：20180801，天津市大茂化学试剂厂）；氨水（批号：20180312，成都金山化学试剂有限公司）；磷酸（批号：20161202，成都金山化学试剂有限公司）；三氯化铝（批号：20180108，天津市大茂化学试剂厂）；氯仿（批号：20171123，成都金山化学试剂有限公司）；甲酸（批号：20180624，成都市科隆化学品有限公司）；丙酮（批号：20180322，成都市科隆化学品有限公司）。

2 方法与结果

2.1 藤茶的TLC鉴别

取金花三叶降糖颗粒（过65目筛）0.2 g，加入甲醇25 mL，超声30 min，滤过，制备供试品溶液；取二氢杨梅素对照品8 mg，杨梅素对照品2 mg，加甲醇10 mL 溶解，制成二氢杨梅素及杨梅素混合对照品溶液；取缺藤茶阴性样品适量（过65 目筛），同供试品制备方法制备阴性对照品溶液。照TLC《中国药典》2020 版四部（通则0502），吸取上述3 种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以氯仿—乙酸乙酯—甲酸（5∶4∶1）为展开剂展开，取出晾干。喷以10%AlCl3溶液显色，置紫外灯（365 nm）下检视。结果供试品与对照品在相同位置上显相同颜色的斑点，且该方法重现性良好，阴性无干扰，可收入金花三叶降糖颗粒质量标准，见图1a。

2.2 荷叶的TLC鉴别

取金花三叶降糖颗粒1 g（过65 目筛），加二氯甲烷15 mL，再加浓氨水1 mL，超声30 min，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇1 mL溶解，即得供试品溶液；取荷叶对照药材0.5 g，同法制备荷叶对照药材溶液；取缺荷叶的阴性样品适量（过65 目筛），同法制备缺荷叶阴性对照品溶液。照TLC《中国药典》2020 版四部（通则0502），吸取上述3 种溶液各8 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以氯仿—丙酮—浓氨水（6∶2∶1）为展开剂展开，取出晾干。置紫外灯（365 nm）下检视。供试品与对照品在相同位置上显相同颜色的斑点，且该方法重现性良好，阴性无干扰，可收入金花三叶降糖颗粒质量标准，见图1b。

2.3 木姜叶柯的TLC鉴别

取金花三叶降糖颗粒0.5 g，加甲醇25 mL，超声处理30 min，滤过，制备供试品溶液；取根皮苷对照品适量，加甲醇溶解制成1 mg/mL的对照品溶液；取缺木姜叶柯阴性样品适量（过65目筛），同供试品制备方法制备阴性对照品溶液。照TLC《中国药典》2020 版四部（通则0502），吸取上述溶液各 5 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯—甲酸—水（10∶1∶1）作为展开剂展开，取出晾干。喷以10 % AlCl3溶液，在105 ℃加热至置紫外灯（365 nm）下检视。结果供试品与对照品在相同位置上显相同颜色的斑点，且该方法重现性良好，阴性无干扰，专属性强，可收入金花三叶降糖颗粒质量标准，见图1。

图1 金花三叶降糖颗粒中藤茶、荷叶、木姜叶柯的TLC 鉴别结果

2.4 金花三叶降糖颗粒中二氢杨梅素、杨梅素、根皮苷的含量测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱为Shim-pack C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）—0.1%磷酸水（B）；梯度洗脱：0～20 min，14 %～26%A ；20～25 min，26 %～40 %A；25～30 min，40% A；流速1 mL/min；检测波长285 nm；进样量5 μL；柱温30 ℃。

2.4.2 供试品溶液制备 精密称定金花三叶降糖颗粒0.2 g（过65 目筛），置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，超声30 min，放冷，补重，滤过，取续滤液，过0.22 μm 微孔滤膜，注入液相小瓶，即得供试品溶液。

2.4.3 对照品溶液制备 取二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素适量，加甲醇制成每1 mL 分别含二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素0.406 8 mg、0.085 4 mg、0.098 7 mg的对照品溶液。

2.4.4 专属性考察 分别取混合对照品溶液、供试品溶液、缺藤茶阴性样品溶液、缺木姜叶柯阴性样品溶液，按“2.4.1项”色谱条件进样测定。阴性样品在目标成分的色谱峰位置的峰面积与供试品目标成分的峰面积的比值小于5%，见图2。

图2 金花三叶降糖颗粒HPLC谱图

2.4.5 线性范围考察 分别取二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素对照品适量，精密称定，加入甲醇分别制备质量浓度为1.245 0 mg/mL、0.275 0 mg/mL 及0.292 1 mg/mL 的混合对照品溶液。另取上述对照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、10 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度线，配制成具有6个浓度梯度的混合对照品溶液。按“2.4.1项”下色谱条件进样测定，记录峰面积。以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归。其线性范围、标准曲线和相关系数（r）结果见表1。

表1 标准曲线

2.4.6 稳定性试验 取0.2 g金花三叶降糖颗粒（批号：20 190801；过65目筛），精密称定，按“2.4.2项”下方法制备成供试品溶液，按“2.4.1项”下色谱条件操作，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h进行测定，记录峰面积，计算RSD。结果二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素峰面积RSD分别为0.657%、0.880%、0.611%。

2.4.7 精密度试验 取混合对照品溶液，按“2.4.1项”色谱条件进样测定，连续进样6次，记录峰面积，计算RSD。结果二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素峰面积RSD为0.089%、0.137%、0.693%。

2.4.8 重复性试验 取样品0.2 g（批号：20 190801；过65 目筛），共6 份，精密称定，按“2.4.2 项”下方法制备成供试品溶液，按“2.4.1 项”下色谱条件操作，记录峰面积，计算二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素含量的RSD。结果二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素含量的RSD分别为3.782%、3.238%、1.791%。

2.4.9 加样回收试验 取金花三叶降糖颗粒（批号：20 190801；过65目筛）0.1 g，精密称定，以二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素含量分别为0.133 2 mg/mL、0.038 2 mg/mL、0.053 6 mg/mL 混合对照品溶液代替甲醇，按“2.4.2 项”下方法制备成供试品溶液，按“2.4.1 项”下色谱条件操作，记录峰面积，计算加样回收率，计算RSD。结果二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素的平均回收率分别为98.37%、99.70%、99.02%，RSD分别为1.24%、0.73%、1.49%，见表2。

表2 加样回收试验n=6

2.4.10 含量测定 取6批金花三叶降糖颗粒各0.2 g，精密称定，按“2.4.2 项”下方法制备供试品溶液，按“2.4.1项”下色谱条件操作进样，记录峰面积，见表3。6 批产品中，二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素的平均含量分别为32.90 mg/g、9.56 mg/g、12.27 mg/g。

表3 6批样品测定结果n=3

3 讨论

TLC具有专属性强、快速、经济、操作简便等优点，被广泛应用于保健产品中成分分析和质量控制。本研究选择藤茶、荷叶、金花茶叶、木姜叶柯进行TLC 研究，其中金花茶叶鉴别阴性干扰较大，专属性不佳，因此不纳入金花三叶降糖颗粒质量控制中。藤茶、荷叶、木姜叶柯的鉴别中专属性强，重现性好，选择可用于金花三叶降糖颗粒质量控制。

依据中药质量标志物理论，对金花三叶降糖颗粒质量标志物进行预测分析，处方中金花茶叶为主药，研究表明，金花茶叶提取物可降低四氧嘧啶致高血糖小鼠的血糖，其正丁醇部位能提高2 型糖尿病小鼠肝糖原含量、GCK 活性及其蛋白表达，上调糖尿病小鼠肝组织GLUT-2 和IRS-1 蛋白的表达[1-2]。金花茶叶主要含有多酚、多糖、黄酮、挥发性物质与皂苷等，但关于其具体降糖物质基础研究较少[3]，故本研究暂未对金花茶叶的成分进行含量测定。藤茶为处方中的帮药，其杨梅素、二氢杨梅素是藤茶降糖作用的重要物质基础[4,13]；木姜叶柯为处方中的帮药，根皮苷是其重要的降糖活性成分[14-17]。因此选择帮药藤茶及木姜叶柯中的二氢杨梅素、杨梅素、根皮苷为金花三叶降糖颗粒的质量评价的特征性成分，为控制金花三叶降糖颗粒质量提供科学依据。

本研究建立了HPLC同时测定金花三叶降糖颗粒中二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素的含量测定方法，通过专属性、线性、稳定性、精密度、重复性、加样回收试验考察，结果表明方法专属性、线性关系、重复性、准确度良好，供试品24 h内稳定性良好，仪器精密度良好，可用金花三叶降糖颗粒质量控制。通过6批产品含量测定，考虑到药材的复杂性，限度按平均值下调20%，暂定金花三叶降糖颗粒中二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素含量不得少于26.32 mg/g、7.65 mg/g、9.82 mg/g。