宏基因组二代测序在肺部感染患者病原体检测中的应用价值*

陈婷婷，江文洁，华晓兰，谢正福

（广西医科大学第一附属医院，南宁 530021）

临床上的肺部感染主要是由多种病原体引起的肺实质炎症反应。临床上针对肺部感染，通常是根据痰、支气管肺泡灌洗液和支刷物的涂片及培养（传统方法）结果，并结合血清学检测和胸部CT 来治疗。肺部感染常见的病原体包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、衣原体、支原体等[1]。在抗生素尚未出现时，肺炎链球菌是肺部感染的第一大“杀手”，然而目前的情况已不是如此，即使有新的检测技术出现，许多患者的病原体诊断仍不明确[2]。由于传统方法和血清学方法检出病原体的阳性率不高，因此通常使用经验性抗感染治疗。但有些患者合并基础疾病或免疫功能低下，其肺部往往有混合感染，导致疗效欠佳，因此快速、简便且准确地检出病原体是治疗肺部感染的第一要务。

宏基因组二代测序（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）是通过对生物样本中提取的核酸进行高通量测序，获取样本中包含的微生物种类和丰度信息。据报道，mNGS 诊断感染性疾病的灵敏度和特异度分别为50.7%和85.7%，在检测结核分枝杆菌、真菌、病毒和厌氧菌方面的灵敏度较高，且抗生素暴露对mNGS 的影响较小[3]。在肺部混合感染中，人类巨细胞病毒和日本肺孢子虫的混合感染最为常见，其次为铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的混合感染，mNGS 的灵敏度明显高于培养法[4]。此外，mNGS 检测可用于鉴定培养为阴性或生长缓慢的病原体，以及诊断罕见或不寻常的感染[5]。目前关于mNGS在肺部感染合并其他疾病中的研究较少，且大多集中在单一病种的研究。本研究回顾性分析了本院58 例肺部感染患者的mNGS结果，初步了解病原体的分布情况，评估在合并肺部基础疾病时mNGS的表现，并与传统方法和血清学检测进行对比，为临床抗感染治疗提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2020 年11 月1 日至2021 年8月31日在广西医科大学第一附属医院老年呼吸内科住院治疗的58例肺部感染患者，符合社区获得性肺炎（CAP）和医院获得性肺炎（HAP）的诊断标准：（1）有受凉或被传染的病史；（2）有咳嗽、咳痰、发热、呼吸急促、呼吸困难等症状；（3）肺部有呼吸音粗、啰音、痰鸣音等体征；（4）胸片或胸部CT有浸润影等炎症改变；（5）抽血化验提示血象升高或降低。排除能够引起发热、咳嗽、咳痰等症状的疾病（如急性支气管炎、慢性阻塞性肺病急性发作等）以及合并肺部肿瘤或自身免疫性疾病的患者。所有患者均行传统病原学检测、血清学检测及支气管肺泡灌洗液mNGS。

58 例肺部感染患者中，男31 例，女27 例；年龄16～82 岁，平均（52.71±14.39）岁，40 岁以上患者占77.6%；根据既往病史、临床症状、肺部体征、实验室检查和胸部CT结果诊断出合并肺部基础疾病患者43 例，包括肺结核19 例，支气管扩张14 例，胸腔积液8例，支气管哮喘2例；临床症状：咳嗽47例，发热9 例，咯血2 例；炎症指标：白细胞计数升高8 例，超敏C反应蛋白升高18例，降钙素原升高9例。

1.2 血清学检测 治疗前，留取患者清晨第一口痰液，进行菌落培养、涂片检查和抗酸染色，并完善早期血清学检测，即通过抽血检测病原体，包括GM实验、G试验、抗酸杆菌DNA定量、新型隐球菌乳胶凝集试验、九项呼吸道病原体IgM 抗体检测（嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、Q 热立克次体、甲型流感病毒、乙型流感病毒及副流感病毒抗体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型）。

1.3 传统病原学检查和mNGS 对所有患者进行支气管镜检查，行肺泡灌洗术，同时留取支刷物（BB）和2 份支气管肺泡灌洗液（BALF），其中一份BALF 送本院检验科进行传统病原学检查（菌落培养、涂片、抗酸染色、GM实验、G试验），另一份外送杰毅生物公司或康圣达医学检验所进行病原体mNGS。所有mNGS 标本的采集、运输和保存严格按照公司或检验所的标准规范执行。本研究mNGS仅对DNA 进行测序，因此未将RNA 病毒纳入分析范围。

1.4 临床解读 由老年呼吸内科两位主治医生和1 位影像科主治医生组成的3 人小组，共同根据患者临床症状、传统和血清病原学检测结果、mNGS报告、胸部CT表现、抗生素疗效及以往的临床诊疗经验等综合判断致患者肺部感染的相关病原体。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件处理数据。计数资料以百分率（%）表示，率的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病原体阳性结果分布情况 通过3 种检测方法共检测出34种病原体，其中检出细菌24种，真菌4 种，病毒5 种，非典型病原体1 种。58 例患者中，mNGS检出符合肺部感染诊断的病例数为42例，检出率72.41%；传统方法检出符合肺部感染诊断的病例数为14 例，检出率24.14%；血清学检出符合肺部感染诊断的病例数为15例，检出率25.86%。

3种检测方法检出同一种病原体仅有3例，检出率为5.17%，检出病原体为曲霉菌（2例）和结核分枝杆菌（1 例）。3 种方法共检出152 株病原体，mNGS共检出86 株病原体，检出率为56.58%，以细菌最为常见，其中分枝杆菌占19.82%，缓症链球菌占9.39%，铜绿假单胞菌和肺炎链球菌均占5.86%，口腔链球菌占3.54%，肺炎克雷伯菌占2.32%；其次为真菌，最后为病毒。分枝杆菌中，结核分枝杆菌占58.82%，非结核分枝杆菌占41.18%；非结核分枝杆菌中又以脓肿分枝杆菌最为常见，占42.86%，龟分枝杆菌、副偶然分枝杆菌、鸟型分枝杆菌、胞内分枝杆菌各占14.29%；真菌中最常见为曲霉菌；病毒中最常见为EB病毒，见图1。

图1 mNGS检出病原体的分布图

传统方法共检出28株病原体，检出率为18.42%，以真菌最为常见，其中曲霉菌占46.4%，白色假丝酵母10.71%，马尔尼菲篮状菌3.57%；其次为细菌，其中分枝杆菌占25.2%，肺炎克雷伯菌、鼻疽诺卡式菌、嗜麦芽窄食单胞菌、白喉棒状杆菌各占3.57%，见图2。

图2 传统方法检出病原体的分布图

血清学检测共检出38 株病原体，检出率为25%，以真菌最为常见，其中曲霉菌占71.06%，新型隐球菌5.27%；其次为细菌，其中分枝杆菌占7.90%，最后为病毒和非典型病原体，各占7.90%，见图3。

图3 血清学检出病原体的分布图

2.2 3种检测方法针对不同病原体的检出率比较 与传统方法和血清学检测比较，mNGS 细菌检出率升高，真菌检出率降低（均P＜0.05）；3 种方法病毒检出率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与血清学检测比较，mNGS 非典型病原体检出率降低（P＜0.05），传统方法分别与mNGS、血清学检测的非典型病原体检出率比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 3种检测方法针对不同病原体的检出率比较n（%）

2.3 3种方法在3种合并肺部基础疾病中病原体检出率的比较 合并肺结核或胸腔积液的患者中，3 种方法病原体检出率两两之间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；合并支气管扩张的14 例患者中，mNGS 检出率较血清学检测升高（P＜0.05），而与传统方法比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 3 种方法在3 种合并肺部基础疾病中病原体检出率的比较n（%）

3 讨论

肺部感染是呼吸系统最常见、病死率最高的疾病之一。mNGS 在2014 年因成功检出钩端螺旋体而被广泛关注[6]，此后也逐渐被应用到病原体检测中。mNGS 可用于痰液、支气管肺泡灌洗液、血液、胸腹水、脑脊液等[7-11]。mNGS在肺部感染中的优势巨大，尤其在病重、反复培养病原体阴性的患者上发挥更大的优势。

本研究中，mNGS 检测肺部感染患者的病原体常见有结核分枝杆菌、曲霉菌、缓症链球菌、铜绿假单胞菌等，其检出率高于传统方法和血清学方法。本研究还发现，3种方法中，mNGS在细菌中的检出率较高，在真菌和非典型病原体中的检出率较低（均P＜0.05），病毒检出率则和其他两种方法比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。在肺部感染的病原体中，因细菌占主要地位，所以mNGS 可以提高患者的病原体检出率，在诊治中可以提供一定的应用价值。然而，mNGS 在真菌和非典型病原体的检出率较低，并且在病毒的检出率不高，这与林明珍等[12]在初治失败的CAP 患者中发现的“mNGS 在真菌、病毒的检出率高”不一致，可能与本研究的样本量较少有关。因此，当考虑肺部感染患者可能为真菌、病毒或非典型病原体感染时，可以结合患者病史、经济等实际情况酌情考虑是否增加mNGS 检测。

mNGS 在合并肺部基础疾病的患者中凸显优势，在合并支气管扩张的患者中mNGS的检出率显著升高，而无论是合并肺结核还是胸腔积液，3种方法的检出率无明显差异。对肺部感染患者的诊治过程中，需结合3 种方法的检测结果及时调整抗菌药物。mNGS 能一次性对上百万条DNA 分子进行测序，甚至能测出不可培养的微生物基因序列，比传统培养更快，检出率、敏感度更高，并且不受宿主因素、抗生素或激素使用的影响[13-14]。mNGS亦存在一定的局限性，例如检测费用高，容易受呼吸道定植菌、机会致病菌的影响，对RNA病毒的敏感度弱，缺乏统一的检测和质控标准[15]。

综上所述，mNGS 比传统方法和血清学检测具有更高的病原体检出率，为肺部感染患者提供了更准确的病原体检测方法，为指导治疗方案提供了新的诊断依据，有助于提高临床诊疗水平。针对病重、合并支气管扩张、反复培养病原体阴性、考虑细菌感染的肺部感染患者，建议入院时尽快完善mNGS检测，针对个体差异进行精确治疗，以降低抗生素使用不当的概率。本研究尚存在一些不足之处：（1）样本量少，有待扩大样本量进一步分析；（2）本研究为回顾性分析研究，未能进行mNGS的特异度分析，对于mNGS的结果判断可能存在一定的差错；（3）mNGS 送检标本并不在本院检验科检测，在运输过程中可能因为保存不善或运输时间长而导致敏感度下降。