组织因子微粒、内皮细胞微粒及血小板微粒在急性髓细胞白血病中检测意义*

戴 益，许玉玲，刘 莹，孙 娜，董海群，刘振芳，赵卫华，程 鹏

（广西医科大学第一附属医院，南宁 530021）

急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）尤其是急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）在治疗早期容易合并出凝血的紊乱[1-2]。微粒（micorparticle，MPs）是细胞在活化、损伤或凋亡过程中释放的直径为0.1～1 μm 亚微米大小的囊泡[3]。到目前为止，许多血栓前状态都有循环MPs 增多的报道，血栓形成的几个因素，如凝血酶、活化蛋白C、炎性细胞因子和高剪应力，都是诱导MPs 形成的因素[4-5]。MPs 作为一种被膜包裹的小囊泡，从各种类型的细胞中脱落出来。它广泛存在于血液、尿液、唾液、乳汁、精液、关节液或脑脊液中[6]。由于MPs 稳定性高，已有部分研究表明，MPs 可作为新的血栓标志物联合D-二聚体（Ddimer，DD）检测能显著提高深静脉血栓的诊断[7]。尽管已有较多文献报道MPs 水平升高与实体肿瘤血栓前状态之间存在关联[8-9]，但迄今为止，在血液系统肿瘤尤其在AML 中关于MPs 的报道仍较少[10-11]。本文采用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测AML 患者血浆中组织因子微粒（tissue factor microparticles，TF+MPs）、内皮细胞微粒（endothelial cell microparticles，EMPs）、血小板微粒（platelet microparticles，PMPs）水平；免疫浊比法检测DD、纤维蛋白降解产物（fibrin degradation product，FDP）水平，观察上述指标在初治AML 患者血浆中的表达状态，并初步探讨在AML凝血之间的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取2021年2月至2021年10月在广西医科大学第一附属医院收治的62例初治AML患者，其中男28 例，女34 例，年龄18～74 岁，平均（48.53±13.94）岁。将64例初治AML患者分为APL组和非APL 组；其中APL 组16 例；非APL 组46 例。病例纳入标准：通过细胞形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学确诊的初治急性髓细胞白血病患者。排除标准：（1）既往发生过血栓或有血栓家族遗传史；（2）其他疾病，如严重肝病、严重感染、其他实体肿瘤导致的凝血紊乱。选取同期相匹配28 例健康志愿者作为对照（正常组）；其中男17 例，女11例，平均（49.50±7.82）岁。本研究已取得医院伦理委员会批准，样本采集均征求受试者及患者家属知情同意。

1.2 主要试剂及仪器 藻红蛋白标记的组织因子特异性荧光CD142 单克隆抗体（CD142-PE）、藻红蛋白标记的内皮细胞特异性荧光CD62e 单克隆抗体（CD62e-PE）、藻红蛋白标记的血小板特异性荧光CD61 单克隆抗体（CD61-PE）和藻红蛋白标记的鼠抗人IgG 单克隆抗体（IgG-PE）均为BD 公司产品。流式细胞系校准微球（0.5 μm；1 μm；2 μm）购自Themo Fisher 公司。DD、FDP 配套检测试剂（购自沃芬公司）。流式细胞仪FC500 为美国Beckman Coulter公司产品。

1.3 标本收集 清晨静息空腹状态下，抽取患者、健康对照者肘静脉血4 mL，枸橼酸钠抗凝，标本置于冰盒中，运输过程中避免剧烈摇晃震动。4 ℃，3 000 r/mim，15 min，取上清1/2重复上述离心，再取1/2 得到乏血小板血浆（platelet-poor plasma，PPP），立即储存于-80 ℃冰箱中。

1.4 免疫荧光标记 冻存样本从-80 ℃的超低温冰箱中取出，37 ℃恒温水浴箱中解冻。采用单染色标记法，向流式检测管中各加入50 μL PPP，分别加入5 μL PE 标记的CD142 单克隆抗体、CD62e 单克隆抗体、CD61单克隆抗体分别标记TF+MPs、EMPs、PMPs，充分混匀，避光孵育30 min。加入445 μL 磷酸盐缓冲液（PBS）将体积调整至0.5 mL，充分混匀后上流式细胞仪检测。选用鼠抗人IgG-PE 抗体作为阴性对照。

1.5 FCM的检测 用0.5 μm、1 μm、2 μm的标准微球设定前向检测区，根据0.5 μm、1 μm、2 μm标准校准微球确定1 μm 的位置，使用流式细胞仪对0～1 μm的微粒进行分析。目的微颗粒的界定：直径在0～1 μm之间的，且PE标记特异性抗体阳性的微颗粒。

1.6 DD、FDP 的检测 DD、FDP 均采用免疫浊比法检测。使用美国Instrumentation Laboratory 的ACL TOP 型全自动凝血分析仪及配套试剂盒检测DD、FDP水平。

1.7 统计学方法 采用SPSS 26.0统计软件分析数据，正态分布计量资料均以均数±标准差（）表示，两组均数比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；偏态分布计量资料以M（P25～P75）表示，两组间比较采用Mann-Whitney U 检验；正态分布的计量资料间的相关分析采用Pearson相关分析，非正态分布的计量资料间的相关性分析采用Spearman 相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TF+MPs、EMPs、PMPs 3 种微粒在FCM 检测方法的建立 根据0.5 μm、1 μm、2 μm 标准校准微球确定1 μm的相对位置，见图1。选用鼠抗人IgG-PE抗体确定阴性组对照所在位置，见图2。用PE标记的CD142单克隆抗体、CD62e单克隆抗体、CD61单克隆抗体分别标记TF+MPs、EMPs、PMPs。共读取20 000 个微粒，对0～1 μm 内的颗粒进行分析，图3A～3C 分别代表落在0～1 μm 内表面标记CD142、CD62e、CD61阳性的微粒。

图1 荧光微球校准珠进行微粒圈门

图2 AML组阴性对照检测结果

2.2 AML组与对照组TF+MPs、EMPs、PMPs检测结果的比较 将AML 组分为APL 组和非APL 组，APL 组、非APL 组、正常组TF+MPs、EMPs、PMPs 检测结果见图1～图3、表1。APL 组患者TF+MPs、EMPs、PMPs 高于非APL 组、正常组（均P＜0.05），见表1。

图3 AML组微粒检测结果

表1 不同组别TF+MPs、EMPs、PMPs检测结果%，

表1 不同组别TF+MPs、EMPs、PMPs检测结果%，

与APL组比较，△P＜0.05。

2.3 AML 组和对照组DD、FDP 检测结果 APL 组患者DD、FDP 水平高于非APL 组、正常组（均P＜0.05），见表2。

表2 不同组别DD、FDP检测结果M（P25～P75）

2.4 相关性分析 相关分析表明，DD 与TF+MPs（r=0.728，P＜0.001）、EMPs（r=0.790，P＜0.001）、PMPs（r=0.615，P＜0.001）呈正相关关系。

3 讨论

在本研究中，笔者纳入了62例初治AML患者，28例健康对照，主要采用FCM检测患者血浆中TF+MPs、EMPs、PMPs 3 种微粒水平。观察它们在初治AML 患者治疗早期的表达情况。笔者发现APL 组患者血浆中的3 种微粒、DD、FDP 水平高于非APL组和正常组（均P＜0.05）。APL是AML的一个特殊的亚型，其特征是在15～17号染色体之间易位。大约至少80%的APL 患者在发病时存在明显的临床凝血障碍[1，12]。一项34 例APL患者的单中心回顾性分析显示，APL 患者其致命性出血发生率为29%，同时12%患者发生了严重血栓栓塞事件。这些事件不仅可发生于诱导治疗过程中，而且可以发生于治疗开始之前[13]。

MPs 是一种小的促凝血膜囊泡，在急性静脉血栓栓塞症（VTE）患者血液中TF+MPs 水平显著升高。Thaler等[14]在它们研究中发现，TF+MPs 的活性在AML相关的弥漫性血管内凝血（DIC）期间升高，证明了TF+MPs 在AML 患者DIC 的发病中可能发挥重要作用。在本次研究中，根据CDSS评分系统，笔者发现62例AML 患者中有3例在治疗早期发生DIC，并对患者血浆MPs 水平进行了检测，发现TF+MPs 的研究结果与上述Thaler 等[14]的报道一致，与他们不同的是笔者还发现EMPs、PMPs 在AML 相关DIC 中也升高，可能与DIC 的发生过程中内皮细胞、血小板的损伤与活化有关。笔者的研究表明TF+MPs、EMPs、PMPs 3 种不同的MPs 在AML 相关DIC 患者血浆中均升高，此外DIC 相关参数DD、FDP 也升高比较明显（均P＜0.05）。Campello 等[15]调查了一组癌症相关VTE 患者与健康对照人群循环MPs的定量和定性特征，发现癌症相关VTE患者血浆TF+MPS、EMPs、PMPs 水平均高于健康人。近来研究发现：MPs可作为静脉血栓形成的危险标志物联合P-选择素和DD 可提高检测DVT 的敏感性和特异性[7]。由于本研究病例数相对较少，血栓的发生率相对较低，因此需要在更大的患者群体中进行进行一步的研究，来评估在AML 患者MPs 升高导致血栓的风险。

本研究探讨了血浆中TF+MPs、EMPs、PMPs 3 种微粒在AML 凝血中的作用，FCM 简单快捷，为AML 患者凝血监测提供了新的选择。但本实验也存在一些不足之处：（1）该研究为单中心小样本研究，病例数相对较少。（2）与之匹配的健康人群样本收集难度较大。（3）考虑到患者的经济原因，入院后只对一小部分患者进行了双下肢静脉B 超检测，实际的血栓发生率可能更高。总之，MPs稳定且广泛存在于人的体液中，微粒的分离和检测方法多种多样，只有使用标准化的定量和定性检测微粒水平，通过前瞻性的多中心研究，将MPs与其他生物标记物（例如DD）和一些临床变量整合到评分系统中，以便提高它们在AML 血栓栓塞中作为诊断生物标记物的能力。