缺氧诱导HIF⁃1α在子宫内膜异位症巨噬细胞极化异常的作用及机制研究

杨如玉 梁炎春 韦雅婧 黄碧淇 杨帆 谭灏 温磊 陆曦 牛刚

1中山大学附属第一医院妇产科（广州 510080）；2中山大学中山医学院（广州 510089）

子宫内膜异位症（endometriosis，EMs，简称内异症）是一种常见的妇科良性疾病，指具有生长功能子宫内膜组织（腺体和间质）出现在子宫腔以外的部位，在育龄期妇女发病率为6% ～ 10%［1］。因其生长、浸润和反复的出血常导致患者出现疼痛、不孕等症状，严重影响患者的生活质量，给患者带来巨大的心理和经济压力［2］。目前学界广泛认可“经血逆流”是子宫内膜异位症的发病机制，但是该学说难以完全解释内异症的具体发生机制。

近年来大量的研究表明，经血逆流可能只是诱因，巨噬细胞状态和功能导致的免疫功能异常是促进内膜黏附、种植和生长的重要催化因素。有研究表明内异症病灶中的巨噬细胞主要表现为M2 型，发挥促进子宫内膜基质细胞的增殖和侵袭的作用，在血管生成、免疫调控等方面也发挥着举足轻重的作用［3-5］。相反，也有其他研究表明，内异症病灶中M2 型巨噬细胞的数量减少，多数巨噬细胞向M1 型转化［6-9］。巨噬细胞作为子宫内膜异位症中最常见的炎症免疫细胞，在EMs 病灶中的分布和功能状态仍待研究，调控其表型转变的机制仍不清楚。

越来越多的证据表明，脱落的子宫内膜碎片进入盆腹腔面临的缺氧微环境可能是调控巨噬细胞表型转变的重要机制。在肿瘤学领域，研究显示缺氧可抑制巨噬细胞mTOR 活性降低和糖酵解，从而抑制M1 的分化和功能，巨噬细胞更多地表现为M2 型［10］。但也有研究认为缺氧上调RAGE的表达，激活了巨噬细胞中的NF⁃κB 信号，促进巨噬细胞向M1 型分化［10］。HIF⁃1α 作为缺氧微环境中至关重要的转录因子，对内异症病灶中巨噬细胞极化状态的调控作用仍不清楚，而且通过改善病灶缺氧微环境，恢复病灶内巨噬细胞的分布平衡，是内异症靶向治疗中很有前景的方向。因此，本研究拟探讨缺氧诱导HIF⁃1α 调节巨噬细胞极化状态的机制，为内异症的发病机制研究提供新的科学依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2021年1月至2021年12月31日在中山大学附属第一医院住院并行手术治疗的患者。17 例子宫内膜异位症患者纳入内异症组，手术标本经术后病理证实为子宫内膜异位症组织，对照组为20 例非子宫内膜异位患者，取自同期因不孕症或者子宫肌瘤而住院治疗的患者，收集在位子宫内膜标本，术后病理证实为无子宫内膜异位症。纳入标准：（1）18～45 岁女性；（2）体质量指数（BMI）：18.5 ～ 24 kg/m2；（3）患者或其法定代理人签署书面知情同意书。排除标准：（1）妊娠期妇女、绝经后妇女；（2）合并严重内科疾病、免疫性疾病、恶性疾病或其他慢性炎症疾病；（3）合并精神疾病者（包含不能配合病例收集过程和随访过程者）；（4）合并急性生殖道感染或盆腔慢性炎症；（5）入院前6 个月内曾使用激素类药物或GnRHa 治疗者、手术史等。本研究经中山大学附属第一医院伦理委员会审批通过，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与材料 THP⁃1 细胞（人类单核细胞白血病细胞系）购买于上海中乔新舟生物科技有限公司，细胞培养胎牛血清、青霉素/链霉素、DMEM/F12、胰酶等均购买于Gibco，佛波酯（Phorbol 12⁃myristate 13⁃acetate，PMA，Abmole）用于诱导THP⁃1 细胞转化为巨噬细胞，氯化钴（CoCl2，Sigma）用于诱导细胞缺氧。RNA 提取试剂盒购买于奕杉生物，Evo M⁃MLV 反转录试剂和SYBR Green Pro Taq HS 购买于艾科瑞生物。兔抗人单克隆抗体CD86（Biosis，1∶300），鼠抗人单克隆抗体CD206（Santa Cruz Biotechnology，1∶400），兔抗人单克隆抗体HIF⁃1α（Cell Signaling Technology，1∶300），DyLight 488 山羊抗鼠和DyLight 594 山羊抗兔荧光二抗（Cell Signaling Technology，1∶500），鼠/兔通用二抗试剂、DAB 显色试剂、过氧化物酶封闭液等购买于广州葆利公司。

1.3 免疫组织化学染色 将标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋后切成4 μm 厚的切片。65 ℃烤片2 h 后，依次经二甲苯脱蜡、乙醇梯度脱水，再经柠檬酸盐缓冲液高温高压抗原修复。修复后PBS清洗3 次，使用内源性过氧化物酶封闭液封闭10 min。PBS 清洗后，使用10%山羊血清封闭1 h，甩干后滴加抗HIF⁃1α 一抗工作液，4℃孵育过夜。第二天室温下复温半小时，PBS 漂洗三次，滴加生物素标记羊抗兔/鼠二抗工作液孵育10 min，PBS 漂洗3 次后，DAB显色液显色1～3 min，最后经自来水冲洗、苏木素复染、梯度乙醇脱水等步骤，使用中性树脂封片，封片后在显微镜下观察。免疫组织化学染色强度评估如下：染色强度评分：无染色（评分0）、弱但可检测（评分1）、强（评分2）、非常强（评分3）；染色区域评分：评分0（无阳性细胞），评分1（1%～25%阳性细胞），评分2（26%～50%阳性细胞），评分3（50% ～ 75%阳性细胞），评分4（75% ～ 100%阳性细胞）。通过将两个分数相加计算总的染色评分。

1.4 双重免疫荧光实验 石蜡标本依次经65 ℃烤片2 h，二甲苯和无水乙醇脱蜡水化，山羊血清封闭后，滴加预先混合的抗CD86、CD206 一抗工作液，4℃孵育过夜。第二天PBS 清洗三次，室温下孵育荧光二抗2 h，继而滴加DAPI 孵育5 min，使用防荧光淬灭剂封片，于荧光显微镜下观察。

1.5 THP⁃1培养和处理 THP⁃1细胞使用RIMP⁃1640（含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL链霉素，50 μmol/L β⁃巯基乙醇）培养，当细胞密度达到80% ～ 90%进行传代种板。将细胞离心，进行细胞计数，以每孔1 × 106个细胞的密度接种到6 孔板中，加入100 ng/mL 的PMA 处理24 h，诱导单核细胞分化为巨噬细胞。24 h 后，弃去上清液，缺氧组加入含有50 ng/mL CoCl2的细胞培养基进行缺氧处理，常氧组加入等量PBS 作为对照。

1.6 实时荧光定量聚合酶链反应（Real⁃time fluo⁃rescence quantitativepolymerase chain reaction，RT⁃qPCR） 收集缺氧和常氧处理后的巨噬细胞，按照RNA 提取试剂盒的说明提取RNA。采用Ta⁃kara 体系将提取的RNA 逆转录为cDNA。RT⁃qP⁃CR 的模板为cDNA，严格参照Takara 体系配置反应体系，荧光定量热循环条件为：95 ℃，2 min；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s，循环40 次。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.7 统计学方法 使用SPSS 21.0 对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以进行描述，两独立组间采用独立样本t检验，非正态分布的资料采用非参数检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫内膜异位症和正常子宫内膜组织中巨噬细胞的分布情况 采用双重免疫荧光技术检测异位病灶和正常子宫内膜组织中巨噬细胞的分布情况，M1 型巨噬细胞的标记物为CD86（绿色荧光），M2 型巨噬细胞的标记物为CD206（红色荧光），细胞核通过DAPI 染色（蓝色荧光）。异位病灶中M1型巨噬细胞密度为（3.87 ± 3.67）个/视野，M2 型巨噬细胞的密度为（24.96±19.76）个/视野，总的巨噬细胞密度为（28.83 ± 21.20）个/视野；正常子宫内膜中M1 型巨噬细胞密度为（0.76 ± 1.00）个/视野，M2 型巨噬细胞的密度为（8.79±7.99）个/视野，总的巨噬细胞密度为（9.55 ± 8.76）个/视野。异位病灶中的巨噬细胞密度大于正常子宫内膜，且以M2型巨噬细胞为主，差异具有统计学意义（P＜0.05，图1）。

图1 正常子宫内膜和子宫内膜异位症中巨噬细胞的分布情况（400×）Fig.1 Distribution of macrophages in normal endometrium and endometriosis（400×）

2.2 子宫内膜异位症病灶和正常子宫内膜组织中HIF⁃1α 表达情况 免疫组织化学检测子宫内膜异位症病灶和正常子宫内膜组织中HIF⁃1α 的表达情况，结果见图2。内异症腺体细胞的HIF⁃1α 表达水平显著高于非内异症患者子宫内膜的腺体细胞［染色强度：（6.31±0.62）分vs.（4.89±2.07）分，P＜0.05，图2E］。内异症间质细胞的HIF⁃1α 表达水平显著高于非内异症患者子宫内膜的间质细胞［染色强度：（5.76 ± 1.00）分vs.（3.93 ± 2.35）分，P＜0.05，图2F］。提示子宫内膜异位症病灶中缺氧更严重，且腺上皮细胞的缺氧程度高于子宫内膜间质细胞。

图2 正常子宫内膜和子宫内膜异位症中HIF⁃1α 的表达情况（200×和400×）Fig.2 Expression of HIF⁃1α in normal endometrium and endometriosis（200×and 400×）

2.3 缺氧通过HIF⁃1α 诱导巨噬细胞向M2 型极化 为探究缺氧条件下巨噬细胞的表型转变情况，使用PMA 将THP⁃1 细胞诱导为巨噬细胞后，使用50 ng/mL CoCl2诱导巨噬细胞缺氧，检测巨噬细胞的极化情况。结果显示HIF⁃1α 的表达升高，M1型标记物IFN⁃γ、CD86、TNF⁃α 的表达水平无变化或变化无统计学意义，M2型标记物CD206，CD163、Arg⁃1、TGF⁃β 表达升高，巨噬细胞表现为M2 型巨噬细胞。结果提示缺氧诱导HIF⁃1α 表达上调，诱导巨噬细胞转变为M2 型，分泌抗炎细胞因子。

3 讨论

本研究采用双重免疫荧光的方法检测了子宫内膜异位症病灶中巨噬细胞的分布情况，结果显示病灶内的巨噬细胞数量增多，以M2 型为主。免疫组化实验揭示异位病灶内HIF⁃1α 的表达升高，腺体中HIF⁃1α 的表达高于间质细胞，表明异位病灶内存在更严重的缺氧状况。进一步的细胞实验表明缺氧可以诱导巨噬细胞表达HIF⁃1α，促进其转变为M2 型巨噬细胞。由此推测，HIF⁃1α 可能是诱导巨噬细胞表型转变的重要转录因子。

巨噬细胞是固有免疫系统的重要组成部分，由单核细胞分化而来，具有提呈抗原、分泌细胞因子、非特异性免疫防御监视等功能，是介导内异症免疫失衡的重要细胞。在不同的刺激因素下，巨噬细胞可以向不同的方向极化，分化为经典激活型（M1 型）或者替代激活型（M2 型）巨噬细胞。M1型巨噬细胞可以被IFN⁃γ、TNF⁃α、LPS 等激活，产生大量促炎性细胞因子IL⁃1β、TNF⁃α、IL⁃6、NO、ROS 等，发挥促炎作用。相反，M2 型巨噬细胞可以被IL⁃4、IL⁃10、IL⁃13 等激活，释放抗炎因子、生长因子和修复因子等，参与组织修复、血管生成、免疫抑制等过程，以抗炎作用为主［11］。本研究结果显示内异症患者异位病灶内的M1、M2 型巨噬细胞的数量都显著高于正常子宫内膜组织，以M2型巨噬细胞为主，表明M2 型巨噬细胞可能是在子宫内膜异位症发生发展过程中起重要作用的细胞，针对M2 型巨噬细胞的靶向治疗有助于改善内异症的相关症状。

但是子宫内膜异位症病灶中的巨噬细胞的表型是动态变化的，随着病变的进展不断发生变化的。研究者采用子宫内膜异位症小鼠模型，在不同的时间段检测病灶内浸润性巨噬细胞的表型。结果显示，在第4 天病变发展早期，巨噬细胞主要表达促炎标记物iNOS 和主要组织相容性复合体Ⅱ（MHC II），但在第7 天后，表达精氨酸酶1 和CD204 的巨噬细胞比例逐渐增高，证明病灶内的巨噬细胞从促炎型M1 巨噬细胞活性过渡到抗炎型M2 巨噬细胞，这种表型的渐进性转变进一步证明M2 型巨噬细胞在子宫内膜异位症样病变发展中起核心作用［12］。本研究中心收集的子宫内膜异位症病例多数因疼痛、不孕等于本中心就诊，并进行手术治疗，多数患者病程长，故而病灶浸润的巨噬细胞主要为M2 型巨噬细胞，M1 型巨噬细胞数量较少。

图3 缺氧处理诱导巨噬细胞转变为M2 型巨噬细胞Fig.3 Hypoxia treatment induces the transformation of macrophages into M2 macrophages

不同表型的巨噬细胞参与内异症发生发展的不同时期，而M2 型巨噬细胞作为内异症发展过程中占主导的免疫细胞，被视为促进内异症发生发展的关键免疫细胞。研究者通过耗竭子宫内膜异位症小鼠体内的巨噬细胞，继而注射不同表型的巨噬细胞，观察病变的进展。结果发现M0 型巨噬细胞不影响病变数目或重量没有影响，但转移M1型巨噬细胞可减少病变重量。相反，转移M2 型巨噬细胞会导致病变重量增加，证明了M2 型巨噬细胞可能对病变的生长和发展起重要作用，而M1 型巨噬细胞具有拮抗作用，可以清除异位内膜组织，破坏病变结构。同时研究也表明M2 型巨噬细胞参与子宫内膜异位症的血管生成过程，耗竭子宫内膜异位症小鼠模型M2 型巨噬细胞，可以降低VEGFA 和TGF⁃β 等促血管生成因子的水平，降低病灶的血管生成，导致病灶的总重量减少［5］。并且，减少M2 巨噬细胞的病变浸润可以显著减少病变的纤维化含量，而巨噬细胞耗竭后系统性过继转移M2a 型巨噬细胞（M2 型巨噬细胞的一种亚型），病灶的纤维化程度增加［13］。本研究发现诱导巨噬细胞转变为抗炎型后，TGF⁃β、Arg⁃1 和IL⁃10等蛋白质mRNA 水平表达增加，研究已经证实这些蛋白质是巨噬细胞参与组织修复、重塑过程的重要生物学分子，而且M2 型巨噬细胞相关的分子标记物CD206、CD163 等可能是内异症的潜在诊断和判断预后的一种方式［14-15］。

目前研究者推测，内异症中巨噬细胞的表型转变可能受到内异症发生发展中微环境变化的调控［12］。与正常在位子宫内膜相比，缺氧是子宫内膜异位症的重要组成和重要特征，是脱落的子宫内膜进入盆腹腔必须面临的微环境改变，可能参与子宫内膜异位症中巨噬细胞功能和表型转变的调控。在肿瘤学领域，缺氧对于巨噬细胞功能的影响是研究的热点。缺氧微环境可以通过上调CCL2、CCL5、M⁃CSF等趋化因子诱导巨噬细胞进入缺氧区域HIF⁃1α 通过促进CCL2 分泌招募单核细胞/巨噬细胞［16-17］，继而下调CCR2、CCR5 等趋化因子受体将其阻滞在缺氧区域，并且缺氧区域的巨噬细胞主要为M2 型巨噬细胞［18］。缺氧区域的巨噬细胞表现出更强的促肿瘤生长、增殖、迁移的能力，促血管生成的能力，免疫抑制以及化疗抵抗的能力［19-20］。

缺氧诱导因子是在缺氧环境中发挥作用的重要调控因子，是由HIF⁃1α 和HIF⁃1β 组成的异二聚体。HIF⁃1β 在常氧和缺氧的情况下可稳定存在，而HIF⁃1α 只有在缺氧条件下能稳定存在，这种特性让HIF⁃1α 成为缺氧条件下最重要的缺氧调节因子。缺氧对于巨噬细胞的调控作用很可能是通过HIF⁃1α 实现的。在胃癌组织中，已有研究证明HIF⁃1α 可以诱导巨噬细胞转变为M2 型，进一步在细胞转录组水平的测序表明缺氧可以上调HIF⁃1α表达，促进巨噬细胞表达抗炎相关因子升高，巨噬细胞表现为抗炎型［21-22］。而且激活HIF⁃1α 可以抑制巨噬细胞NF⁃κB 的激活和随后促炎细胞因子的产生，特异性抑制脂多糖刺激的巨噬细胞分化为M1 细胞［23］。本研究显示子宫内膜异位症病灶存在更严重的缺氧，腺体的缺氧程度高于间质。进一步在细胞水平，发现缺氧通过上调HIF⁃1α，诱导巨噬细胞的M1 型标记物TNF⁃α、CD86、IFN⁃γ 表达，M2 型标记物Arg⁃1、TGF⁃β、CD206、CD163 等表达升高。以上结果证明在子宫内膜异位症中，缺氧微环境也可以通过上调HIF⁃1α 促进巨噬细胞向抗炎型巨噬细胞转化。

巨噬细胞表型是通过综合比较多种细胞因子和表面标记物的表达而确定，与其他研究一样，在组织实验水平，检测异位病灶中巨噬细胞表型的标记物数量有限，使得很难真正定义内异症中复杂的巨噬细胞表型，虽然此研究使用的分子标记物CD86、CD206分别为目前公认且广泛使用的M1、M2型巨噬细胞标记物。为展示不同时期内异症病灶中巨噬细胞的组成和探索巨噬细胞表型的动态转变，应该收集不同分期的临床标本进行研究，但本研究使用的组织标本缺乏早期病灶，研究不够全面。

综上所述，子宫内膜异位症异位病灶中巨噬细胞密度显著增加，而且以M2 型为主。HIF⁃1α 是缺氧诱导巨噬细胞转变为M2 型的重要调控因子。如何改善异位病灶的缺氧微环境，调控巨噬细胞的极化状态，可能为挖掘新的治疗靶点提供新的思路。