沙门菌sRNA GcvB及伴侣蛋白Hfq对靶基因stm4351的调控作用

张家莉, 杨 阳, 潘 永, 段世宇, 令狐远凤, 杨 琦,3

(1.贵州大学动物科学学院；2.贵州大学动物疫病研究所；3.贵州省动物疫病研究室，贵州 贵阳 550025)

沙门菌(Salmonella)是一种广泛存在于自然界的革兰氏阴性菌，具有极强的感染性和致病力，能够引起人和动物伤寒、腹泻甚至全身性感染等疾病[1].当前，其被公认为是世界上最重要的人畜共患病原菌之一.2017年全球出现1 430万例人类感染沙门菌的病例，其中13.59万人死亡[2].

ABC转运系统(ATP-binding cassette transporter)是细菌生命活动中至关重要的一环，主要影响细菌对氨基酸的吸收，其通常具有至少一种周质溶质结合蛋白，蛋白经外膜孔扩散，通过结合、水解ATP而获得能量并将多种底物分子如氨基酸类、多肽类、无机离子、金属离子、糖类转出(入)细胞，从而对细菌的生存、致病性等产生重要影响[3-5].沙门菌中，stm4351长741 bp，编码精氨酸ABC转运蛋白底物结合蛋白，其受长为200 nt的反式编码调控 sRNA GcvB调控[6-7].以stm4351的mRNA起始密码子为原点，GcvB可能与其-30～-22的区域(CACAACAUC)进行配对结合[8].该sRNA来自于靶基因不相邻基因区间，与靶基因具有较低的互补性.因此，其具有较强的调节能力,能调控沙门菌中约1%的mRNA，对氨基酸转运和代谢的多个靶标的表达具有负调节作用[9-10].反式编码调控sRNA大多需要伴侣蛋白Hfq共同作用，而GcvB是革兰氏阴性细菌中与Hfq相关性最高的sRNA之一.

有关GcvB与伴侣蛋白Hfq对靶基因stm4351的具体调控方式还未明确.本试验成功构建了stm4351的启动子与lacZ基因的融合基因，lacZ能与stm4351共用起始密码子(ATG)进行翻译并表达出β-半乳糖苷酶(LacZ)，此时lacZ的表达量可视为stm4351的表达量.通过P22噬菌体转导试验将GcvB及Hfq单缺失和双缺失菌株转入Δstm4351∷lacZ中，以Δstm4351∷lacZ作为对照，利用LacZ活性和stm4351相对转录量差异评价GcvB、Hfq对stm4351的调控作用，为探究sRNA对沙门菌的调控机理及制定沙门菌的防控措施奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)标准株LT2、7455菌株(含有质粒pKD46，pKD46是λ red同源重组质粒，携带氨苄抗性)、鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株(基因型Δhfq∷tetRA)、鼠伤寒沙门菌gcvB基因缺失株(基因型ΔgcvB∷cat)[11]、鼠伤寒沙门菌hfq和gcvB基因双缺失菌株(基因型Δhfq∷tetRAΔgcvB∷cat)为本实验室构建.

P22噬菌体、质粒pCP21(含有FLP重组酶，能识别FRT位点)、pCE40(携带FRT位点与lacZ基因，但无lacZ启动子)、pKD13(携带FRT位点，具卡那霉素抗性)均由法国国家科学研究中心分子遗传学Bossi实验室惠赠.PCR产物纯化试剂盒和RNA提取试剂TRIzol均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；试剂均为分析纯.

根据NCBI提供的基因序列设计引物(表1)，引物送至上海生物工程有限公司合成.

表1 试验所用引物1)Table 1 Primers used in the experiment

1.2 构建单缺失菌株Δstm4351∷lacZ

参照文献[12]，以质粒pKD13作为模板，利用引物P1、P2进行PCR扩增.扩增体系：10 μL pKD13，8 μL buffer，57 μL ddH2O，上、下游引物各1 μL，2 μL dNTPs Mix(2.5 mmol·L-1),1 μL Taq 酶和Pfu 酶(3∶1).扩增程序：95 ℃变性10 s、53～60 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，30个循环.将PCR产物纯化后保存于-80 ℃.

将7455菌株培养至D600 nm=0.5～0.7，7 500 r·min-1离心6.5 min，用甘油洗净.将洗净的菌液与目的片段混匀，倒入电转杯中进行电转化(t=5.9 s、U=2.5 V)，电穿孔后迅速用1 mL复苏液复苏，37 ℃孵育1 h，抽取100 μL菌液涂布于相应抗性平板上，37 ℃过夜培养，次日在同抗性平板上挑取菌落进行纯化培养.通过电转化将质粒pCP21、pCE40依次转入纯化菌种中，然后在卡那霉素抗性平板与麦康凯培养基上进行筛选.通过PCR产物凝胶电泳与测序验证lacZ与stm4351是否替换成功.

1.3 构建双缺失和三缺失菌株

参照文献[13]制备裂解液：将供体菌过夜培养，取0.3 mL菌液加入2.3 mL P22肉汤中，培养8 h后转到2 mL离心管中，10 000 r·min-1离心2 min，取上清液用CHCL3灭菌，获得裂解液.

转导：将受体菌过夜培养，取100 μL菌液与50 μL裂解液(1∶50)混匀，在37 ℃摇床中孵育1 h后涂布于相应抗性选择培养基中过夜培养.

分别将基因缺失株Δhfq∷tetRA、ΔgcvB∷cat和Δhfq∷tetRAΔgcvB∷cat作为供体菌，stm4351缺失株作为受体菌进行转导.通过抗性平板进行筛选，获取双缺失菌株、三缺失菌株：stm4351ΔgcvB∷cat、stm4351Δhfq∷tetRA、stm4351Δhfq∷tetRAΔgcvB∷cat.

1.4 LacZ活性测定

参照文献[14]，将Δstm4351∷lacZ、stm4351ΔgcvB∷cat、stm4351Δhfq∷tetRA、stm4351Δhfq∷tetRAΔgcvB∷cat培养至D600 nm=0.3～0.5，记录D600 nm值.取0.1 mL菌液，用Z buffer定容至1 mL，加入0.2 mL ONPG (4 mg·mL-1)开始反应，记录加入时间(t0)；当液体变为黄色时加入0.5 mL 1 mol·L-1Na2CO3终止反应，记录终止时间(tf);将试管中液体以5 000 r·min-1离心30 s后，以Z buffer作空白对照，测D420 nm值，记录数据.计算LacZ活性.

1.5 stm4351转录量测定

参照文献[15]，根据DNA提取试剂盒说明书，利用引物P9、P10进行PCR扩增.扩增体系为上游引物1 μL、下游引物1 μL、2×Taq DNA master mix 12.5 μL、ddH2O 6.5 μL、DNA模板4 μL.扩增条件：95 ℃预变性30 min；95 ℃变性5 s、 60 ℃退火30 s，35个循环.

提取各菌株的总RNA样本，将其反转录为cDNA，以此作为模板，参考SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书，进行两步法反应.扩增条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，39个循环.每个样本3个重复，采用2-ΔΔCt法[16]计算相关基因mRNA的转录水平.

2 结果与分析

2.1 Δstm4351∷lacZ的构建结果

对构建的菌株进行PCR验证，获得目的条带并测序(图1，图2).与原片段进行对比发现，stm4351成功被lacZ基因替换，获得菌株Δstm4351∷lacZ.

M.DL2 000 marker；1.stm4351验证.图1 stm4351基因与lacZ融合的PCR检测Fig.1 PCR detection on lacZ fusion of stm4351 gene

灰色为LT2菌株与stm4351缺失菌株上游同源序列；黑色框中为起始密码子；划线部分为替换基因序列.图2 lacZ基因替换stm4351基因的部分序列Fig.2 Partial sequence of stm4351 gene replaced by lacZ gene

2.2 双缺失、三缺失菌株的构建结果

通过转导，对各菌株进行PCR鉴定，再进行PCR凝胶电泳(图3)，成功构建出缺失菌株.

M.DL2 000 marker；1.stm4351验证(660 bp)；2.gcvB验证(696 bp)；3.hfq验证(1 964 bp).图3 stm4351 ΔgcvB∷cat、stm4351Δhfq∷tetRA、stm4351Δhfq∷tetRAΔgcvB∷cat菌株的PCR检测Fig.3 PCR detection on stm4351 ΔgcvB∷cat， stm4351Δhfq∷tetRA， stm4351Δhfq∷tetRAΔgcvB∷cat

2.3 基因缺失对LacZ活性的影响

将Δstm4351∷lacZ、stm4351ΔgcvB∷cat、stm4351Δhfq∷tetRA、stm4351Δhfq∷tetRAΔgcvB∷cat菌株分别在麦康凯培养基上划线培养，长出的菌落均为红色(图4).这表示lacZ基因已经成功将stm4351替换，且各菌株均具备发酵乳糖产酸的能力.

1.Δstm4351∷lacZ; 2.stm4351ΔgcvB∷cat; 3.stm4351Δhfq∷tetRA; 4.stm4351Δhfq∷tetRAΔgcvB∷cat.图4 基因缺失菌株在麦康凯培养基上的生长情况Fig.4 Growth of gene deletion strains in Maconkey medium

由图5可以看出，与对照组WT(Δstm4351∷lacZ)相比，gcvB或hfq缺失以及gcvB与hfq同时缺失后，LacZ活性均有所上升,分别上升2.6、3.4、4.2倍.由此说明，gcvB缺失后stm4351蛋白表达量变化显著(P<0.05)，hfq单缺失及hfq与gcvB同时缺失后stm4351蛋白表达量变化极显著(P<0.01)

*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01).图5 不同基因缺失菌株的β-半乳糖苷酶活性Fig.5 β-galactosidase activity in different gene deletion strains

2.4 基因缺失对stm4351转录水平的影响

由图6可以看出，与对照组LT2相比，hfq缺失后stm4351的转录量极显著下降(P<0.01)，而gcvB缺失及hfq与gcvB同时缺失后stm4351的转录量变化不显著(P>0.05).

图6 不同基因缺失菌株的stm4351相对转录量Fig.6 Relative transcription levels of stm4351 in different gene deletion strains

3 讨论

细菌中存在一类sRNA，长度为40～400 nt，能进行转录但不进行翻译，对细菌中重要基因的表达有抑制或激活作用，进而维持细菌的稳定及调节细菌重要的生命活动和致病性[17].有研究认为，sRNA结合在核糖体结合位点的附近，占据核糖体与mRNA的结合位点，以抑制翻译起始从而刺激mRNA的降解[18].根据编码调控方式，sRNA分为两类：一类为基于碱基对完全互补配对的顺式编码调控sRNA；另一类为通过不完美的碱基配对发挥调控功能的反式编码调控sRNA.反式编码调控sRNA在发挥其调控作用时常存在一种伴侣蛋白Hfq[19].Hfq是一种保守的细菌RNA结合蛋白，是RNA结合蛋白的Sm样家族的成员之一，充当调节性RNA伴侣，能促进sRNA与其mRNA靶标之间的碱基配对，并直接调节某些mRNA的翻译，进而影响特定转录物的翻译和更新.GcvB是革兰氏阴性菌(如大肠杆菌、沙门菌)中反式编码调控sRNA中的一种，与伴侣蛋白Hfq协同作用，对靶基因产生调控作用.

Sharma et al[8]通过RNA混合算法(hybrid algorithm)对鼠伤寒沙门菌进行预测，认为stm4351为GcvB的靶基因.Montaseri et al[20]使用gRNA进行预测，得到了同样的结论.本研究结果显示：在蛋白水平上，gcvB或hfq缺失后，LacZ活性均有所上升；gcvB与hfq同时缺失后，stm4351基因的表达水平比单缺失菌株高.因此，可推测GcvB、Hfq均对stm4351的表达存在抑制作用，且在Hfq的辅助作用下，GcvB对stm4351表达的抑制作用增强.在mRNA水平上，当hfq缺失后，stm4351转录量显著下降，说明在mRNA水平上，GcvB仅与stm4351结合，并未表现明显的调控作用.sRNA作为转录后调控因子，与靶标mRNA 5′UTR区域进行碱基配对，从而占据核糖体与mRNA的结合位点，抑制mRNA的翻译，使得mRNA失去核糖体保护而被降解[21].由此推测,GcvB极有可能通过碱基配对与Hfq结合,再与stm4351形成GcvB-Hfq-stm4351的复合体，以此竞争核糖体与mRNA的结合位点，使得核糖体不能结合到链上，从而抑制stm4351的转录.gcvB缺失后，stm4351转录量并未产生显著变化，说明Hfq还可能与其他sRNA结合进行相应的调节作用，也可能通过其他途径或方式进行调节.gcvB与hfq同时缺失也未使stm4351转录量发生显著变化，推测另一种调控stm4351基因转录或翻译的机制被激活,且这种机制可能受GcvB或Hfq的负调控,该机制值得进一步探究.

4 结论

本试验成功构建了沙门菌基因缺失菌株Δstm4351∷lacZ、stm4351ΔgcvB∷cat、stm4351Δhfq∷tetRA、stm4351 Δhfq∷tetRAΔgcvB∷cat.沙门菌中GcvB、Hfq均能够对stm4351的翻译产生抑制作用；GcvB在伴侣蛋白Hfq的辅助作用下对stm4351的抑制作用增强；Hfq可能通过2种或更多的途径对stm4351进行调控；Hfq对stm4351的保护或激活作用可能受到GcvB的影响.