黄麻黄脉病毒侵染性克隆的构建及应用

林文忠, 李景远, 彭诗山, 韩 星, 翟盈盈, 杜振国, 张 洁, 吴祖建

(1.福建农林大学植物病毒研究所/闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室，福建 福州 350002；2.福建泉州市洛江区农业农村和水务局，福建 泉州 362011)

菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒是双生病毒中分布最广泛、种类分化最多和危害程度最大的一类病毒，给烟草、番茄、棉花等经济作物带来重大经济损失[1-6].根据病毒的基因组类型，双生病毒可以分为单组分(仅DNA-A)和双组分(含DNA-A和DNA-B)；根据病毒的进化关系，双生病毒分为新世界病毒(New World virus)与旧世界病毒(Old World virus)，新世界病毒主要为双组分病毒，旧世界病毒主要为单组分病毒，常伴有卫星分子，但也有少数是双组分病毒[7-8].其中，DNA-A的正义链上编码2个开放阅读框(open reading frame, ORF)(AV1和AV2)，互补链上编码4个ORF(AC1～AC4)，DNA-B病毒链和互补链各编码1个ORF(BV1和BC1).在DNA-A和DNA-B非编码区存在一个共同区(common region, CR)或基因间隔区(intergenic region, IR)，该区域包含一个序列、位置和结构上高度保守的核苷酸序列(TAATATT/AC)，含有病毒复制起始位点[7-8].双生病毒侵染性克隆的构建必须包括2个完整的IR区[9].

黄麻(Corchoruscapsularis)，又称为绿麻、火麻等，是椴树科(Tiliaceae)黄麻属(Corchorus)重要的纤维作物，种植量和用途的广泛度仅次于棉花，在长江以南被广泛栽培，为精准扶贫做出了重要的贡献[10-11].黄麻黄脉病毒(Corchorusyellowveinvirus, CoYVV)最早于2006年在越南的黄麻上被发现[12]；本课题组于2015年在我国福建省福州地区的黄麻上鉴定到该病毒[13].CoYVV属于菜豆金色花叶病毒属，可侵染黄麻并造成花叶、黄脉、植株矮化等症状，影响黄麻产量与品质，对我国黄麻产业具有潜在威胁.其基因组为双组分，作为旧世界病毒，CoYVV还具有典型的新世界双生病毒特征，即不编码AV2蛋白.本研究拟构建CoYVV的侵染性克隆，验证福州黄麻花叶病的病原，以期为CoYVV基因组功能及其致病机制的研究奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

感病黄麻的总DNA由本实验室提取和保存，其中含有CoYVV DNA-A(NCBI登录号：KX101212)和CoYVV DNA-B(NCBI登录号：KX101213).

pTOPO-BamHⅠ克隆载体、pBINPLUS双元表达载体、GV3101农杆菌菌株由本实验室保存；大肠杆菌T1感受态购自北京全式金生物技术有限公司.

胶回收试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；质粒快速小提试剂盒、Marker Ⅲ(MD103)购自天根生化科技(北京)有限公司；StarMarker D15k购自北京康润诚业生物科技有限公司；Trans2k Plus DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司.

1.2 DNA-A侵染性克隆的构建

DNA-A侵染性克隆的构建采用同源重组法.以感病黄麻总DNA为模板，利用引物CoYVV-DNA-A-F1(5′-caggtcgactctagaggatccACCGTGCAGCAGCCCCGC-3′)/CoYVV-DNA-A-R1(5′-GGCTGCTGCACGGTAATATTATAGGCGTGCAGCAGCG-3′)、CoYVV-DNA-A-F2(5′-AATATTACCGTGCAGCAGCCCCGC-3′)/CoYVV-DNA-A-R2(5′-aattcgagctcggtacccgggTGACCTTCCCTGTATGAGCA-3′)(小写字母代表与载体反向互补的同源臂序列)分别对DNA-A进行扩增，获得长度为2.7 kb左右的片段A和0.5 kb左右的片段B.扩增体系：总DNA 1 μL，正向引物(10 μmol·L-1) 1 μL，反向引物(10 μmol·L-1) 1 μL，dNTP Mix 0.5 μL，2×Phanta Max Buffer 12.5 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase (Vazyme) 1 μL，ddH2O 8 μL.反应程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，52 ℃退火15 s，72 ℃延伸100 s，35个循环，72 ℃终延伸10 min.产物经1%(质量分数)琼脂糖凝胶回收.利用FastDigestBamHⅠ和FastDigestSmaⅠ(以下所用内切酶均为FastDigest)对pBINPLUS载体进行双酶切，酶切体系：质粒DNA 1 μg，BamHⅠ 1 μL，SmaⅠ 1 μL，10×FastDigest Green Buffer 2 μL，ddH2O补至20 μL，37 ℃反应30 min.载体酶切产物标记为pBINPLUS-SB，经1%琼脂糖凝胶回收.

按照多片段无缝克隆试剂盒(MultiS One Step Cloning Kit)的说明书(Vazyme)，将片段A和片段B以及酶切产物pBINPLUS-SB，按一定比例的摩尔数进行混合.反应体系：5×CE MultiS Buffer 4 μL，Exnase®MultiS 2 μL，片段A 54 ng，片段B 10 ng，酶切产物pBINPLUS-SB 240 ng，ddH2O补至20 μL，37 ℃反应30 min.转化大肠杆菌后，提取质粒，BamHⅠ和SmaⅠ双酶切验证阳性克隆，标记为pBINPLUS-CoYVV-1.2A(图1A).利用电击法将其转入农杆菌GV3101菌株.

1.3 DNA-B侵染性克隆的构建

DNA-B侵染性克隆的构建采用传统的酶切连接法.以感病黄麻总DNA为模板，根据φ29 DNA聚合酶试剂盒(GE Healthcare)的说明书进行滚环扩增，扩增产物利用BamHⅠ酶切得到2.7 kb左右的片段，将其连接于pTOPO-BamHⅠ载体，即为pTOPO-DNA-B.利用BamHⅠ和SmaⅠ对pTOPO-DNA-B进行双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳后回收较小的2.6 kb左右的片段C.将片段C连接至pBINPLUS-SB，连接体系：片段C 6 μL，pBINPLUS-SB 2 μL，T4 Ligase (Promega) 1 μL，10×T4 Ligase Buffer 1 μL，4 ℃反应过夜.转化大肠杆菌后，提取质粒，利用BamHⅠ和SmaⅠ双酶切验证阳性克隆，标记为pBINPLUS-DNA-B-SB.利用BamHⅠ对pBINPLUS-DNA-B-SB进行单酶切，1%琼脂糖凝胶电泳回收后，进行去磷酸化处理，去磷酸化体系：单酶切载体片段17.5 μL，10×CIAP缓冲液2 μL，CIAP (TaKaRa) 0.5 μL，37 ℃反应30 min，过柱纯化即可.

利用BamHⅠ对pTOPO-DNA-B进行单酶切，1%琼脂糖凝胶电泳后回收较小的2.7 kb左右的片段D.将片段D与上一步去磷酸化的载体连接，转化大肠杆菌后，提取质粒，利用引物B-F570(5′-GACGAACCGTCACGTGCATCCACG-3′)/B-R570(5′-TGTCGACAGCAAAGCACTCTGTTG-3′)检测插入片段及其方向，阳性克隆标记为pBINPLUS-CoYVV-2.0B(图1B).利用电击法将其转入农杆菌GV3101菌株.

A.CoYVV DNA-A侵染性克隆构建;B.CoYVV DNA-B侵染性克隆构建.AC1～AC4、AV1、BC1、BV1：CoYVV开放阅读框；IR：基因间隔区；LB、RB：载体左、右臂.图1 CoYVV侵染性克隆构建示意图Fig.1 Schematic diagram for the construction of CoYVV containing infectious clone

1.4 农杆菌接种及检测

农杆菌接种方法参考文献[9].使用医用去除针头的1 mL一次性注射器，吸取等比例混合的DNA-A和DNA-B侵染性克隆的农杆菌菌液，接种于刚长出2～3片真叶的黄麻叶片，接种的黄麻置于防虫温室(16 h光照/8 h黑暗)中培养，同时设置未接种的空白对照，每隔3 d观察一次植株症状.接种30 d后，采集黄麻叶片，采用CTAB法提取其总DNA，利用引物A-F534(5′-AGGATCTATCGGACCTATAGGTCC-3′)/A-R534(5′-AGGATTAGAGGCATGAGTACATGC-3′)和B-F673(5′-ACGAATATCGTCTGACTCATGACC-3′)B-R673(5′-TCCAGCATACTTGTGCTGAGTCTG-3′)分别对病毒两个组分进行PCR检测，扩增产物送交生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析；接种60 d后，采集黄麻叶片约0.5 g，提取其总DNA进行Southern blot检测(Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ).

2 结果与分析

2.1 侵染性克隆的构建

将同源重组获得的重组载体pBINPLUS-CoYVV-1.2A进行双酶切验证，得到12 kb左右的载体片段和3.3 kb左右的片段(图2A)，表明DNA-A侵染性克隆载体构建成功.将传统酶切连接获得的重组载体pBINPLUS-CoYVV-2.0B进行特异性引物检测，得到0.5 kb左右的片段(图2B)，表明DNA-B侵染性克隆载体构建成功.

M.分子质量标准;A.CoYVV DNA-A侵染性克隆载体酶切分析;B.CoYVV DNA-B侵染性克隆载体PCR分析.图2 CoYVV侵染性克隆载体鉴定 Fig.2 Verification of CoYVV infectious clone vectors

2.2 农杆菌接种结果

接种CoYVV侵染性克隆30 d后，黄麻产生黄脉、花叶、斑驳、卷叶等症状(图3).PCR检测结果显示，接种黄麻植株均可见DNA-A和DNA-B的特异性条带，而健康植株无任何条带(图4)；测序表明，该条带确实是病毒基因组序列，说明所构建的侵染性克隆已成功侵染黄麻.Southern blot检测结果显示，接种黄麻植株可见病毒DNA-A组分的积累，而健康黄麻植株无任何特异性条带(图5)，表明病毒已在黄麻体内大量复制.

CK.健康黄麻；DNA-A+DNA-B.接种病毒侵染性克隆的黄麻.图3 黄麻接种CoYVV侵染性克隆30 d后的症状Fig.3 Symptoms of jute inoculated with CoYVV infectious clone for 30 d

M.分子质量标准；1～3.DNA-A；4～6.DNA-B；CK.健康黄麻.图4 黄麻接种CoYVV侵染性克隆30 d后的PCR检测Fig.4 PCR detection of the viral DNA components in jute inoculated with CoYVV infectious clone for 30 d

1.接种病毒的黄麻；CK.健康黄麻.图5 黄麻接种CoYVV侵染性克隆60 d后的Southern blot检测Fig.5 Detection of DNA-A component in jute inoculated with CoYVV infectious clone for 60 d by Southern blotting

3 讨论

病毒侵染性克隆不仅是病毒病病原鉴定的基础，也是病毒基因功能及其与寄主植物互作研究的重要前提[14-15].目前，双生病毒侵染性克隆的构建策略已经成熟[16-19].Ha et al[12]早在2006年即鉴定了CoYVV，虽然利用本氏烟(Nicotianabenthamiana)NT1细胞证明了CoYVV DNA-A AC1/AC2/AC3可以起始DNA-B的复制，但未能构建其侵染性克隆.本研究构建了CoYVV的侵染性克隆，将其接种于健康黄麻植株，能引起与田间发病类似的症状，并且从接种的植株上检测到了CoYVV基因组组分，完成了科赫氏法则的验证.本研究对接种黄麻植株进行Southern blot检测时，DNA-A组分显示病毒已积累，但是对DNA-B组分的多次检测均未能得到较好的结果，推测可能的原因是杂交探针设计不够特异，然而，PCR的结果可以证实DNA-B组分的存在.已知双生病毒DNA-A与病毒的复制和介体传播有关，很多双组分双生病毒DNA-A单独存在可以系统侵染寄主，但不能诱导典型的病害症状；而DNA-B组分对于诱导典型的病害症状是必需的，并能增加DNA-A组分的积累量，且必须依赖DNA-A组分进行复制[9,16,20].本研究中，DNA-A具有较高的积累量，且黄麻症状明显，表明CoYVV侵染性克隆构建成功.