Pib、Pi9、Pi2、Pi54和Pish在粳稻品种(系)中的分布及对穗颈瘟的抗性

何弯弯，王健康，丁成伟，郭荣良，吴玉玲，王友霜，赵轶鹏，胡婷婷

(江苏徐淮地区徐州农业科学研究所，江苏 徐州 221121)

【研究意义】由子囊菌(Magnaportheoryzea)引起的稻瘟病属于世界性病害，严重威胁水稻产量，导致其每年损失高达10%～30%[1-2]。因此，稻瘟病已成为影响水稻高产、稳产和粮食安全的重要原因之一。目前在中国已有的稻瘟病防治措施中，培育和种植抗稻瘟病水稻品种(系)是最经济可行和安全有效的防控措施。【前人研究进展】目前育种家进行抗病品种选育，主要基于材料的抗性和表型性状，具有选育时间较长、效率低、工作量大、操作麻烦等一系列缺点。到目前为止，已鉴定出90多个稻瘟病抗性基因，其中已成功克隆超过39个抗性基因[3-4]。大量的紧密连锁的或功能分子标记被开发和利用，为快速、精确、系统地检测供试材料的基因型及高效率聚合抗病基因，选育抗性好综合性状优的品种(系)奠定基础。李刚等[5]利用Pib、Pi9、Pi2和Pigm等10个抗性基因的分子标记检测了500多份材料，发现Pi9、Pib等4个基因对6个强致病小种的抗性较强；曾正明等[6]指出Pi9是四川稻区的主要抗稻瘟病基因；王宝祥等[7]利用抗性基因Pi-ta、Pib、Pi54和Pikm的分子标记对88份黄淮海稻区品种进行研究，发现Pib和Pi54在品种中分布最广。在河南水稻育种中，Pi9和Piz-t是主要抗稻瘟病基因，而Pita尚未被充分利用[8]。【本研究切入点】本课题组在多年的育种工作中积累了丰富的种质资源，但对这些种质资源的抗稻瘟病基因的分布情况以及抗性水平并不完全清楚。本研究利用稻瘟病抗性基因Pib、Pi9、Pi2、Pi54和Pish的分子标记，对搜集到的93份粳稻品种(系)进行穗颈瘟田间抗性鉴定及抗性基因检测分析。【拟解决的关键问题】通过分析93份种质资源的抗性基因分布情况以及单基因或不同基因组合对穗颈瘟的抗性效应，为稻瘟病抗性育种提供可靠的理论依据和重要的抗病资源。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试水稻品种(系)为来自江苏、山东、河南、天津、浙江等地区的93份材料。

1.2 稻瘟病抗性鉴定方法

供试菌株为2015-248A3、2016-218C、2015-335D7、139E和2015-80F1，由江苏省农业科学院植物保护研究所提供。人工接种稻瘟病菌混合孢子液[9]，具体操作如下：在水稻孕穗至破口期，采用人工注射接种进行穗瘟鉴定，混合孢子液浓度为5×104个/mL，在水稻成熟后调查接菌结果。水稻穗颈瘟分级标准详见DB32T1123—2007水稻品种(系)抗稻瘟病鉴定方法与抗性评价技术规程(表1)。

表1 水稻穗颈瘟的调查分级及抗性评价标准

1.3 稻瘟病抗性基因的检测

利用抗稻瘟病基因Pib、Pi9、Pi2、Pi54和Pish的基因功能标记或连锁标记检测供试材料，引物名称、序列及扩增片段大小见表2。

表2 抗稻瘟病基因的分子标记引物

在水稻3～4叶幼苗期取新鲜叶片，采用CTAB法提取基因组DNA。引物序列由上海擎科生物工程有限公司合成。PCR反应体系和程序以及产物检测方法参照何弯弯[10]及表2中参考文献。

2 结果与分析

2.1 品种所含基因型及其所占比例

利用5个抗性基因的特异性标记对93份材料进行检测(表3)。结果表明，93份材料包含了5个标记对应的所有基因，其中19份材料含有3个抗性基因，占总数的20.4%，抗性比例为21.05%；25份材料含有2个抗性基因，占总数的26.9%，抗性比例为44%；28份材料含有1个抗性基因，占总数的30.1%，抗性比例为28.57%；21份材料未检测到抗性基因，占总数的22.6%，抗性比例为33.33%(表4)。含有1个抗性基因的材料数量最多，含有2个抗性基因的材料抗性比例最高。携带抗性基因Pib、Pi9、Pi2、Pi54和Pish的材料分别为49份(52.7%)、16份(17.2%)、8份(8.6%)、31份(33.3%)、31份(33.3%)(图1)。Pib基因在检测材料中所占比例最高，Pi2基因在检测材料中所占比例最低。

表3 93份水稻品种(系)基因型检测及抗性水平

续表3 Continued table 3

表4 携带不同抗性基因数的分布频率及抗性比例

图1 5个稻瘟病抗病基因在供试材料中的分布频率Fig.1 Frequency of the five blast resistance genes in varieties(lines)

在93份材料中，基因型所占比例较多的是Pib+Pi54、Pib+Pish、Pib+Pi9+Pi54、Pib+Pi54+Pish，其中Pib+Pi54基因型的材料12份，占总数的12.9%；Pib+Pi9+Pi54和Pib+Pi54+Pish基因型的材料均是7份，各自占总数的7.5%；Pib+Pish基因型的材料6份，占总数的6.5%(表5)。同时未检测到携带4个及以上抗性基因的材料。

表5 不同抗性基因型品种(系)的抗性鉴定结果

2.2 水稻品种(系)稻瘟病抗性水平

利用江苏省农科院植保所提供的5个稻瘟病生理小种的混合孢子液对93份材料进行穗颈瘟抗性鉴定。迟粳预68、镇671、和X45689等3份材料表现免疫，占比为3.22%；宏稻59、灵谷糯6号和泗14-26等6份材料表现高抗，占比为6.45%；浙粳20、赛粳988和泗15-301等21份材料表现中抗，占比为22.58%；盐稻1333、隆粳99和皖垦糯1号等41份材料表现感病，占比为44.08%；皖垦津清、信粳787和金稻20等22份材料表现高感，占比为23.7%(表3)。

2.3 不同抗性单基因及基因组合对穗颈瘟的抗性

为了探明水稻品种(系)所含的抗性基因数量与抗病性的相关性，本研究将基因检测结果与抗性水平相结合进行分析。只检测到抗性基因Pib、Pi9、Pi2、Pi54和Pish的材料分别为9、2、3、2和12份，抗性比例分别为22.22%、50%、33.33%、100%和16.67%(表5)。Pi9和Pi54的抗性比例都在50%以上，但检测到含这两个基因的材料的数量较少；包含Pish基因的材料最多，但抗性最差。在基因组合中，含有2个抗病基因Pib+Pi9、Pib+Pi2、Pib+Pi54、Pib+Pish和Pi9+Pi54的材料分别有2、2、12、6和1份，抗性比例为50%、100%、25%、66.67%和100%；含有3个抗病基因Pib+Pi9+Pi54的材料有7份，抗性比例分别为42.86%；而Pib+Pi54+Pish的材料也是7份，但抗性比例为14.29%，表明品种携带的抗病基因数量与其抗性水平并不完全正相关。

3 讨 论

稻瘟病严重威胁我国水稻的增产和稳产，因此，抗稻瘟病品种的培育和种植是防治该病害最经济、安全和有效的措施[17-19]。近年来，水稻新品种审定将稻瘟病抗性列为一个关键的衡量指标，新审定的品种均要达到中抗以上水平[5]。传统的水稻抗病育种主要依靠大量的田间接种鉴定、抗性遗传以及目标性状筛选，既费时费力，又易受环境条件影响，无法适应当前对抗病选育俺的技术需求。随着分子生物技术的发展，与抗性基因紧密连锁的分子标记的开发及应用,尤其是对抗性基因的功能性标记的开发,明显提升了抗源筛选和抗性基因鉴定及育种选择的效率,成为精准选择抗性基因的有效途径[12,20]。

本研究利用5个抗稻瘟病基因对93份材料进行分析研究。Pib、Pi9、Pi2、Pi54和Pish以不同的频率出现在检测材料中，其中Pib的检出率为52.7%，占所有材料中比例最高，但其对稻瘟病抗性的贡献较小，且聚合其他基因后对品种抗性的提高作用不显著。而抗病基因Pi9和Pi54对这几个生理小种的抗性表现较好，但检出率很低。将抗性基因分布和抗性水平相结合进行分析，结果表明，携带2个抗病基因(Pib+Pi9、Pib+Pi2、Pib+Pish和Pi9+Pi54)的品种(系)具有较强的抗性，但其所占的比例较低。供试材料抗性低的主要原因是含抗病基因占比少或未携带有效抗病基因。于此同时，笔者也发现，未鉴定出抗性基因的材料中也表现出抗病性以及携带相同基因或基因型组合的品种间抗性也存在差异，这可能与品种间是否携带其他抗性基因有关系，也可能受病菌侵染时环境效应的影响。

4 结 论

随着水稻基因组研究的迅速发展，在抗稻瘟病育种中，抗性基因可操作性强、效果显著，育种家应注重遗传背景多样性，引入新型抗性基因资源，开展主效抗病基因的鉴定及其应用，同时聚合多个抗病基因，培育和推广种植具有广谱抗性的水稻新品种(系)。本研究仅检测了5个抗稻瘟病基因，在今后的工作中，仍需对其他稻瘟病抗性基因检测及抗病性分析评价。