血管生成素1在高同型半胱氨酸血症大鼠血浆中高表达及对内皮细胞的保护作用

沈童童，周利民，董双双，王欣欣，徐小红，刘 玉，郑 凡，马劭博，沈 兵

血管生成素1(angiopoietin 1, Ang 1)由血管壁细胞、周细胞和某些其他细胞生成，主要表达于血管内皮细胞，并与其特异性受体型酪氨酸激酶Tie-2的配体结合[1-2]。Ang 1具有促进血管内皮细胞迁移、增殖、侵袭和防止渗漏等作用[3-4]。但其在高同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)血症引起的血管内皮功能损伤修复中的作用未见报道。

Hcy异常升高被广泛认为是心血管疾病的独立危险因素之一。过多的Hcy会导致血管内皮功能损伤，引起血管的新生、收缩、通透性等功能改变，其分子机制复杂[5]。该研究探讨高Hcy饲料喂养的SD大鼠血浆中Ang 1变化及其对血管内皮细胞迁移和增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试剂与仪器 Ang 1(货号：13667-H02H1)购自北京义翘神州生物技术有限公司；Ⅰ型胶原蛋白酶(货号：SCR103)、Hcy(货号：H4628)购自德国Merck公司；CCK-8试剂(货号：A311-01)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司公司；Label-free质谱仪Orbitrap Fusion、液相色谱Easy nLC/Ultimate 3000购自美国Thermo Scientific公司；倒置显微镜(德国Zeiss公司)；SpectraMax M5读板仪(美国Molecular Devices公司)。

1.1.2实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠，体质量200～220 g，安徽医科大学动物中心提供。自由进食进水，饲养室温维持(22±1)℃。

1.2 方法

1.2.1高Hcy血症动物模型 对照组和实验组各4只SD大鼠，对照组大鼠采用anAIN93M基础饲料喂养，高Hcy血症模型组采用同样基础饲料，但不含叶酸、维生素B12和维生素B6。两种饲料都含有1%的磺胺噻唑，可以抑制肠道细菌形成叶酸。5周后成模，CO2窒息处死后迅速进行心脏穿刺取血，采用化学发光法测定血清Hcy水平。

1.2.2Label-free蛋白质谱分析 将大鼠血浆去除中高丰度蛋白后，低丰度蛋白浓缩冻干，复溶后测浓度，取60 μg蛋白溶解后加入胰蛋白酶37 ℃降解16 h，样品经过毛细管高效液相色谱分离后进行质谱仪分析，后续再予以Label-free分析获得蛋白质信息。

1.2.3肠系膜动脉内皮细胞原代培养 将健康雄性SD大鼠CO2窒息处死，用剪刀解剖大鼠腹部，一次性针筒插入左心室，用无菌生理缓冲液灌流直至肝脏变白，剥离其肠系膜动脉血管，分离多余的脂肪组织，将肠系膜动脉血管剪碎，用Ⅰ型胶原蛋白酶消化(37 ℃，10 min)，离心后弃上清液，加入1 ml培养基，吹打混匀，移至培养皿中，1 h后换液。

1.2.4细胞划痕实验 用Marker笔在6孔板背后沿着直尺大约每隔0.5 cm划一道线，横穿过孔(每孔5～6条线)，每孔加入约5×105个细胞，37 ℃培养箱过夜培养，第2天用200 μl枪头沿着直尺与标记线垂直的方向划两条平行线，用无菌PBS洗去划掉的细胞，加入培养基放入培养箱(37 ℃、5% CO2)，按0、24 h用倒置显微镜观察，拍照。

1.2.5CCK-8细胞增殖实验 首先在无血清的培养基中同步化细胞，继而在96孔板中配制100 μl/孔的细胞悬液，将培养板在培养箱中预培养24 h(37 ℃、5% CO2)。弃除培养基，向培养板加入100 μl/孔不同浓度的Hcy标准品，在培养箱孵育24 h，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，在培养箱中孵育4 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度值。

2 结果

2.1 高Hcy血症大鼠血浆蛋白改变蛋白质谱实验共检测到对照组和高Hcy血症组大鼠血浆中555个蛋白，其中5个蛋白(Mmrn1、Tgfb1、Ctsa、Ang 1、Golgb1)在血浆中的表达量上调，17个蛋白(RGD1565617、Psmb1、Psma6、Jchain、Tfrc、Lamp2、Igh-6、LOC103690319、Sell、Cd5l及7个未知蛋白)表达量下调(图1A)；将两组出现差异表达的蛋白进行聚类分析，两组样本具有较一致的变化趋势(图1B)。

图1 蛋白质谱火山图和热点图A：蛋白质谱火山图；红色点：上调的蛋白；绿色点：下调的蛋白；黑色点：无显著性差异的蛋白；B：蛋白质谱热点图；1～4：实验组；5～8：对照组；红色：上调；绿色：下调

2.2 高Hcy血症大鼠血浆Ang 1蛋白浓度表达变化高Hcy血症大鼠血浆Hcy浓度比对照组升高[(3.72±0.43 )μmol/Lvs(36.82±6.22 ) μmol/L,n=4,t=-5.309,P<0.05]。在蛋白质谱检测结果中，对照组和高Hcy血症组大鼠血浆Ang 1蛋白含量差异如图2所示，与对照组相比，实验组大鼠血浆中Ang 1蛋白含量升高(t=-3.748,P<0.05)。

图2 大鼠血浆Ang 1蛋白表达水平A：两组大鼠血浆Ang 1蛋白质谱结果热点图：1～4：实验组；5～8：对照组；B：变化倍数统计数据；与对照组相比较：*P<0.05

2.3 Ang 1对Hcy抑制的大鼠肠系膜动脉内皮细胞迁移的影响Ang 1(600 ng/ml)处理内皮细胞24 h后，与对照组相比，血管内皮细胞划痕后的愈合率增强[(21.76%±1.71%)vs(33.18%±3.61%),n=8,t=-2.859,P<0.05](图3A)；另一组采用0、10、30、50 μmol/L的Hcy处理内皮细胞24 h，结果显示30、50 μmol/L的Hcy处理组划痕后的愈合率受到抑制(图3B、C)；第三组采用0 μmol/L Hcy+溶剂对照、30 μmol/L Hcy、30 μmol/L Hcy+Ang 1(600 ng/ml)、50 μmol/L Hcy、50 μmol/L Hcy+Ang 1(600 ng/ml)分别处理内皮细胞24 h，结果显示Ang 1阻断了30 μmol/L Hcy引起的划痕后愈合抑制效应，但Ang 1没有阻断50 μmol/L Hcy引起的划痕后愈合抑制效应(图3D)。

图3 Ang 1对Hcy抑制的肠系膜动脉内皮细胞迁移的阻断作用A：Ang 1对肠系膜动脉内皮细胞迁移的影响(n=8)；与对照组比较：△P<0.05；B、C：不同浓度Hcy对肠系膜动脉内皮细胞迁移的影响(n=8)；与0 μmol/L Hcy组比较：▽P<0.05；D：Ang 1对不同浓度Hcy抑制的肠系膜动脉内皮细胞迁移的阻断作用(n=8)；与0 μmol/L Hcy+0 ng/ml Ang 1组比较：*P<0.05；与30 μmol/L Hcy+0 ng/ml Ang 1组比较：#P<0.05

2.4 Ang 1对Hcy抑制的大鼠肠系膜动脉内皮细胞增殖作用的影响实验以肠系膜动脉内皮细胞为研究对象，结果显示，0、10、30、50 μmol/L的Hcy处理内皮细胞24 h后，30、50 μmol/L的Hcy抑制了内皮细胞增殖(图4A)；另一组采用0 μmol/L Hcy+溶剂对照、30 μmol/L Hcy、30 μmol/L Hcy+ Ang 1(600 ng/ml)、50 μmol/L Hcy、50 μmol/L Hcy+Ang 1(600 ng/ml)分别处理内皮细胞24 h，结果显示，Ang 1阻断了30 μmol/L Hcy引起的增殖抑制效应，但对50 μmol/L Hcy抑制的增殖无阻断作用(图4B)。

图4 Ang 1对Hcy抑制的肠系膜动脉内皮细胞增殖的阻断作用A：不同浓度Hcy对肠系膜动脉内皮细胞增殖的影响(n=3)；与0 μmol/L Hcy组比较：&P<0.05；B：Ang 1对不同浓度Hcy抑制的肠系膜动脉内皮细胞增殖的阻断作用(n=6)，与0 μmol/L Hcy+0 ng/ml Ang 1组比较：*P<0.05；与30 μmol/L Hcy+0 ng/ml Ang 1组比较：#P<0.05

3 讨论

美国心脏协会在2014年将Hcy血浆水平>10 μmol/L作为高Hcy血症的临床诊断标准[5]。2018年修订版的《中国高血压防治指南》中将血浆中Hcy水平修订为≥15 μmol/L作为诊断高Hcy血症的临床标准[6]。血浆中过高的Hcy可引起血管内皮功能损伤，参与动脉粥样硬化的发生发展，从而引起一系列心脑血管疾病[7-9]，因此，阐明高Hcy血症在高血压及各种心脑血管疾病发生发展中的作用具有重要意义。

研究[10]显示，Hcy可通过增加细胞内的活性氧引起线粒体途径的凋亡，参与心脑血管疾病的发生发展。抗氧化剂可缓解Hcy引起氧化应激并激活VEGF-VEGFR-FAK信号通路导致的内皮功能损伤[11]。也有研究[12]报道补充Hcy代谢调节中的叶酸可抑制Hcy引起的脐静脉内皮细胞凋亡。在Hcy对血管生成素影响方面，仅有文献报道Hcy处理可显著抑制脐静脉内皮细胞的Ang 1和2的表达[13]，但血管生成素对高Hcy引起的内皮功能损伤的抑制作用国内外文献未见报道。因此，阐述血管生成素对高Hcy引起的内皮功能损伤的调节作用具有重要的理论意义和应用价值。蛋白质谱检测方法可以从一个样本中同时鉴定多种蛋白质类型及其表达水平，是蛋白组学研究的重要手段[14]，本研究采用蛋白质谱方法从动物水平研究显示，高Hcy血症大鼠血浆蛋白表达谱出现改变，多个蛋白出现上调或下调，其中Ang 1在高Hcy血症大鼠血浆中也上调。而Ang 1具有促进血管内皮细胞迁移、增殖、侵袭和防止渗漏等内皮保护作用，因此猜测，在高Hcy血症大鼠中，Ang 1可能为反射性的升高，从而阻断高Hcy引起的内皮功能损伤，是一种内皮保护性的代偿机制。为证实该推测，本实验以与血压形成密切相关的阻力血管，即肠系膜上动脉为研究对象，通过原代培养肠系膜上动脉内皮细胞并进行实验验证。结果显示，Hcy可浓度依赖地抑制内皮细胞迁移和增殖，说明一定浓度的Hcy可引起内皮细胞功能损伤。但是，当一定浓度的Ang 1与Hcy共同处理内皮细胞时，阻断了低浓度Hcy抑制的内皮细胞迁移和增殖，但不能阻断高浓度Hcy引起的内皮损伤。说明Ang 1只能在一定范围内对Hcy引起的内皮损伤有修复作用。本研究中的高Hcy血症大鼠血浆中，Hcy浓度为36.82 μmol/L左右，与本研究细胞实验中Ang 1有效阻断Hcy引起内皮功能损伤的Hcy浓度接近，说明Ang 1在高盐饮食情况下会起到一定的血管内皮功能保护作用。因此，高Hcy血症一方面可引起血管内皮损伤，另一方面可引起细胞合成和分泌蛋白增强或减弱。其中，高Hcy反射性引起Ang 1在血浆中含量升高，而升高的Ang 1可在一定程度上阻断了高Hcy引起的内皮功能损伤，可能参与高Hcy血症时内皮功能的代偿机制。另一方面，该结果也提示Ang 1在Hcy血症引起的血管内皮功能损伤中也具有潜在治疗价值。但本研究仍未阐明，在高Hcy血症大鼠血浆中升高的Ang 1通过何种细胞内信号通路抑制Hcy引起的血管内皮细胞损伤以及Ang 1来自于何种组织细胞。

综上所述，高Hcy血症可显著影响部分血浆蛋白分泌，且高Hcy血症模型大鼠血浆中升高的Ang 1可在一定浓度范围内参与阻断高Hcy引起的血管内皮功能损伤。该研究揭示了一种高Hcy血症血管内皮功能代偿机制，也为Ang 1在Hcy血症引起的血管内皮功能损伤治疗中提供潜在的新方法和新靶点。