基于网络药理学和分子对接研究黄葵胶囊治疗糖尿病肾病的作用机制

焦圆圆 方锦颖 卓莉 李文歌

摘要 目的：基于网络药理学和分子对接方法分析黄葵胶囊治疗糖尿病肾病的作用机制。方法：通过化源网数据库、中药与化学成分数据库、PubChem数据库以及文献查阅，搜集黄葵胶囊化学成分，运用Swiss ADME数据库筛选出黄葵胶囊活性成分，依据Swiss Target Prediction数据库预测黄葵胶囊各活性成分靶点;通过GeneCards数据库和在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）检索糖尿病肾病疾病相关靶点，利用韦恩图获取黄葵胶囊治疗糖尿病肾病的关键靶点，通过R3.6.2软件对靶蛋白进行基因本体（GO）生物过程富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。通过Cytoscape 3.7.2软件构建黄葵胶囊治疗糖尿病肾病的“关键活性成分-重要靶点-通路”网络，最后利用AutoDock进行分子对接，计算最低结合能。结果：黄葵胶囊治疗糖尿病肾病的核心活性成分为4′，5，7，8-四甲氧基黄酮、槲皮素、没食子酸、原儿茶酸等，核心靶点PIK3R1、PIK3CA、AKT1、SRC、ESR1等，活性成分与关键靶点分子对接的最低结合能均接近-5 kcal/mol。黄葵胶囊治疗糖尿病肾病的作用机制可能与内分泌抵抗、缺氧诱导因子-1（HIF-1）信號通路、表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂耐药机制、雌激素信号通路等有关。结论：本研究初步验证黄葵胶囊可通过多成分、多靶点、多通路治疗糖尿病肾病的作用，为黄葵胶囊的进一步研究提供理论依据。

关键词 黄葵胶囊;糖尿病肾病;网络药理学;分子对接;活性成分;靶点;信号通路;作用机制

Mechanism of Huangkui Capsules in the Treatment of Diabetic Nephropathy Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

JIAO Yuanyuan1，2，FANG Jinying2，3，ZHUO Li2，LI Wenge1，2

（1 Graduate School of Peking Union Medical College，Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100730，China; 2 Department of Nephrology，China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China; 3 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

AbstractObjective： To explore the mechanism of Huangkui Capsules in the treatment of diabetic nephropathy based on network pharmacology and molecular docking. Methods： The chemical components of Huangkui Capsules were collected from ChemSrc，Chinese medicine and chemical component database，PubChem，and available literature.The active ingredients of Huangkui Capsules were screened from Swiss ADME and the target genes of the active ingredients in Huangkui Capsules were predicted by Swiss Target Prediction.The genes associated with diabetic nephropathy were obtained from GeneCards and Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）.Venny2.1.0 was used to identify the key targets shared by Huangkui Capsules and diabetic nephropathy.R3.6.2 was used to perform gene ontology（GO） annotation and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome（KEGG） pathway enrichment for the key targets.Cytoscape 3.7.2 was employed to establish an “active ingredient-target-pathway” network for Huangkui Capsules in the prevention and treatment of diabetic nephropathy.Finally，AutoDock was used for molecular docking between active ingredients and key targets and calculating the lowest binding energy. Results： The major active ingredients of Huangkui Capsules in the treatment of diabetic nephropathy were 4′，5，7，8-tetramethoxyflavone，quercetin，gallic acid，and protocatechuic acid，and the key targets were PIK3R1，PIK3CA，AKT1，SRC，and ESR1.The lowest binding energy between the active ingredients and the key targets was close to -5 kcal/mol.Huangkui Capsules may treat diabetic nephropathy via endocrine resistance，epidermal growth factor receptor（EGFR） tyrosine kinase inhibitor resistance，hypoxia-inducible factor-1（HIF-1） signaling pathway，and estrogen signaling pathway. Conclusion： Huangkui Capsules can treat diabetic nephropathy through multiple ingredients，targets，and signaling pathways，which provides a theoretical basis for further research on Huangkui Capsules.13394B73-CB2C-4322-A0A1-5D8D25E41881

Keywords Huangkui Capsules; Diabetic nephropathy; Network pharmacology; Molecular docking; Active ingredient; Target; Signaling pathway; Mechanism

中圖分类号：R285;R289.5 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2022.09.011

糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）是糖尿病微血管病的主要并发症之一，其患病率逐渐上升，目前已取代慢性肾小球肾炎，成为导致终末期肾病（End-stage Renal Disease，ESRD）的最主要病因[1-2]。受DN的临床特点和病理学变化存在明显差异的影响，DN的治疗仍具有一定挑战。目前改善全球肾脏病预后组织（Kidney Disease：Improving Global Outcomes，KDIGO）指南推荐治疗DN的主要方法包括积极控制血糖，使用钠-葡萄糖协同转运蛋白2（Sodium-glucose Linked Transporter-2，SGLT-2）抑制剂及肾素-血管紧张素-醛固酮系统（Renin-Angiotensin-Aldosterone System，RAAS）抑制剂等[3]。除此之外，研究表明单味中药和中药复方制剂可以降低DN患者蛋白尿，改善肾功能，延缓DN进入ESRD时间[4]。黄葵胶囊（Huangkui Capsule，HKC）作为黄蜀葵花的提取物制剂，有清热、利湿、解毒之效。研究表明，HKC具有抗炎、抗氧化、清除自由基、保护肾小管上皮细胞及抗纤维化等作用。临床证实HKC够显著降低DN患者的蛋白尿，保护肾功能，其效果优于单用RAAS阻滞剂类药物[5]。但是，黄葵胶囊治疗DN的作用机制尚不十分明确。本研究以黄葵胶囊为研究对象，应用网络药理学的研究方法[6]，探究黄葵胶囊的活性成分和相关重要靶点，创建主要活性成分-靶点-通路的关系网络，深入研究黄葵胶囊治疗DN的作用机制，同时为后续研究提供理论参考。

1资料与方法

1.1黄葵胶囊活性成分及相关靶点筛选通过化源网、中药与化学成分数据库等方式获得黄葵胶囊主要活性成分，并结合文献进行补充。主要化合物的名称和2D结构通过检索PubChem数据库获得。同时将化合物的2D结构上传至Swiss ADME数据库，并依据胃肠道吸收及类药性（Drug Likeness，DL）进行筛选。将筛选出符合ADME条件的化合物的2D结构上传至Swiss Target Prediction数据库，纳入其中置信度>0的活性成分靶点，最后确定黄葵胶囊主要活性成分和靶点。

1.2DN疾病相关靶点筛选确定“diabetic nephropathy”为主题词，搜索GeneCards（https：//www.genecards.org/）、在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（https：//omim.org/）获取DN相关靶点。通常GeneCards数据库中，评分越高代表该靶点与疾病关联越紧密。因此，当靶点数目较多时可通过将评分大于中位数的相关靶点作为DN潜在靶点。利用韦恩图将2个数据库结果取并集得到DN靶点。通常设定数据库中Score值大于中位数的靶点为DN潜在靶点，如靶点数目多可进行2次或以上取中位数，通过GeneCards得到Score最大值190.56，最小值0.58，2次取中位数结果为9.02，故选择Score大于9.02的靶点作为DN的重要靶点。利用OMIM数据库对相关靶点进一步补充。

1.3黄葵胶囊成分-DN靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络构建为明确黄葵胶囊药物相关靶点与DN靶点之间的作用关系，通过Venny2.1.0网站（https：//bioinfogpcnb.csic.es/tools/venny/index.html）制作韦恩图将二者靶点取交集。将共同靶基因录入String数据库（https：//string-db.org/）创立蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）网络[7]，平台物种选择设置为“Homo sapiens”，互相作用最小阈值设置为“highest confidence”（>0.9），去除独立基因，获取PPI的关系，同时制作PPI网络图。得到的分析结果另存为tsv文件，运用Cytoscape 3.7.2软件中的NetworkAna1yzer插件对结果进行参数分析。

1.4黄葵胶囊活性成分-DN靶点功能和通路富集分析功能富集分析主要是将列表中的基因或蛋白分成多个部分，即将获得的基因按照功能或其他标准进行分类，把具有相似功能的基因放到一起，并将其与生物学表型关联起来[8]。将获得的疾病-药物交集基因，通过R3.6.2软件对交集基因进行ID转换及功能富集分析，包括基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析及京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，根据 P <0.05并使用Bonferroni检验法进行校正，筛选出具统计学意义的生物过程和信号通路，并将结果运用R3.6.2软件可视化。

1.5黄葵胶囊活性成分-DN靶点-通路图的建立 通过Cytoscape 3.7.2软件，建立“药物成分-关键靶点-通路”关联图，同时利用该软件中的NetworkAna1yzer插件计算黄葵胶囊有效成分及关键靶点的连接度（Degree）及介度（Betweenness）等系统参数。最终根据NetworkAna1yzer计算结果总结出起主要治疗作用的药物活性成分及作用的核心靶点。13394B73-CB2C-4322-A0A1-5D8D25E41881

1.6分子对接验证 分子对接对象选取PPI网络中连接度（Degree）值最大的5个靶点。分子对接是验证药物活性成分和药物作用靶点结合能力的重要方法。通过AutoDock软件对黄葵胶囊核心化合物和度值排名前5的靶点进行分子对接。将蛋白质结构数据库（Protein Data Bank，PDB）（https：//www.rcsb.org/）下载的靶蛋白的三维结构（PDB ID分别是5UBR、5M6U、4HXJ、1UNQ、1HCQ，pbd格式），通过PyMol对其进行分离原配体和去水的操作后，继续AutoDockTools软件进行蛋白加氢和计算电荷，结果保存为PDBQT格式的文件。将Pubchem数据库中下载的主要活性成分三维结构的sdf文件，利用OpenBabel将其全部置换成3D的MOL2格式文件。再次利用AutoDockTools对MOL2格式文件进行同样处理，结果保存为PDBQT格式文件并作为配体参与分子对接。通过AutoDock软件完成黄葵胶囊核心化合物与重要靶点分子对接，最后通过GraphPad Prism 8.0.1将分子对接得到的结合能数值可视化。当受体与配体分子对接中结合的构象越稳定时能量越低，发生作用的可能性越大。通常结合能≤-5.0 kcal/mol（1 cal=4.185 J）时，药物活性成分与靶点具有较好的结合活性。

2结果

2.1黄葵胶囊活性成分筛选及靶点获取共有6个活性成分符合条件，分别为4′，5，7，8-四甲氧基黄酮、槲皮素、烟酰胺、没食子酸、原儿茶酸及尿嘧啶。共获得116个成分靶点。

2.2DN靶点获取对GeneCards数据库和OMIM数据库相关DN进行筛选以及并集共获得1 055个DN疾病靶点。

2.3药物活性成分-疾病靶点PPI网络的构建获得黄葵胶囊-DN共同靶点50个。见图1。排名前20黄葵胶囊和DN关键靶点信息见表1。PPI网络中节点面积最大的靶点分别是PIK3CA和PIK3R1，其次为SRC1。见图2。

2.4靶点功能与通路的富集结果显示，黄葵胶囊参与的生物过程主要涉及氧化应激反应、氧代谢及细胞化学应激反应等。GO生物过程富集分析前20条富集基因通路见图3。KEGG信号通路富集分析结果显示参与的信号通路主要有内分泌抵抗、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药机制、缺氧诱导因子-1（HIF-1）信號通路、磷脂酶D信号通路等。前20条富集基因通路见图4，表2。

2.5药物重要活性成分-DN靶点-通路图的建立主要药物重要活性成分-DN靶点见图5。Cytoscape拓扑分析结果显示4′，5，7，8-四甲氧基黄酮连接度为23，介度0.22，紧密度0.58，其次为槲皮素连接度为20，介度0.15，紧密度0.55，预测4′，5，7，8-四甲氧基黄酮和槲皮素为黄葵胶囊治疗DN主要成分。见表3。PIK3CA在网络中的连接度为20，介度0.10，紧密度0.58，PIK3R1的连接度为20，介度0.10，紧密度0.57，预测PIK3CA和PIK3R1为黄葵胶囊治疗DN的最主要靶点。SRC、AKT1、EGFR、IGF1R等亦为相对重要靶点。

2.6分子对接与黄葵胶囊的4个主要活性成分见图6。主要活性成分4′，5，7，8-四甲氧基黄酮与4种度值（Degree）较高靶点蛋白结合能均接近-5.0 kcal/mol，槲皮素与SRC、AKT1结合能优于没食子酸及原儿茶酸但后二者结合能亦接近-5.0 kcal/mol。黄葵胶囊和靶点蛋白间具有较好的结合能力。4′，5，7，8-四甲氧基黄酮、槲皮素为黄葵胶囊治疗DN主要成分，PIK3CA、SRC、AKT1为其可能作用的主要靶点蛋白。

3讨论

DN发病机制复杂，除常见高血压、高糖、代谢异常、血流动力学改变、免疫炎症反应以及氧化应激外，非编码RNA及纤维化亦共同作用导致DN的发生发展[9-10]。临床治疗除常规RAAS阻滞剂外，2020年改善全球肾脏病预后组织指南推荐SGLT2抑制剂作为DN治疗的一线用药，能够预防或减少蛋白尿，改善肾小球高滤过等延缓DN进展[11]，但并不适用于重度肾功能不全患者。临床常规应用黄葵胶囊治疗DN，能一定程度降低蛋白尿，保护肾功能，改善患者临床症状。

黄葵胶囊提取自单味中药黄蜀葵花，医书《嘉祐本草》提及，黄蜀葵花作为锦葵科秋葵属植物黄蜀葵的花朵，具有清热除湿、消肿解毒等作用。根据化源网结合文献报道共收集到黄葵胶囊活性成分47种[12-13]，本研究通过网络药理学方法筛选出黄葵胶囊治疗DN的活性成分为4′，5，7，8-四甲氧基黄酮、槲皮素、没食子酸及原儿茶酸等。其中主要活性成分4′，5，7，8-四甲氧基黄酮和槲皮素均属于黄酮类化合物。既往研究证实黄酮类化合物可通过抑制氧化应激、改善免疫炎症、调节肾间质纤维化等多种途径治疗DN，能有效降低血糖、尿蛋白和提高肾小球滤过率[14-15]。槲皮素具有良好抗炎、抗氧化等作用。研究发现槲皮素可通过Hippo途径抑制DN系膜细胞增殖，延缓DN进展[16]，还可以通过减少转化生长因子-β的表达，延缓肾间质纤维化[17]。分子对接结果亦证实，4′，5，7，8-四甲氧基黄酮、槲皮素与主要靶点（PIK3CA、AKT1、SRC）的结合能力较强，因此黄葵胶囊可能主要通过4′，5，7，8-四甲氧基黄酮、槲皮素等治疗DN。

本研究结果表明，黄葵胶囊治疗DN的靶点主要集中在PIK3R1、PIK3CA，而AKT1、SRC亦为重要靶点。PIK3R1、PIK3CA均为磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）蛋白家族成员，分别是PI3K的调节亚基、催化亚基。通过上游通路激活PI3K，PI3K活化后引起AKT的结构改变，而后者可经磷酸化作用进一步促进或抑制下游的底物如凋亡蛋白的改变，进而调控细胞的增殖、凋亡等。在DN动物模型中激活PI3K/AKT途径可促进系膜细胞增殖，加速DN进展[18]，而下调PI3K/AKT通路可减轻足细胞凋亡，增加肾病蛋白表达[19]。13394B73-CB2C-4322-A0A1-5D8D25E41881

对黄葵胶囊治疗DN的重要靶点进行GO生物通路富集分析发现，关键靶点参与的生物过程包括：氧化应激反应、氧代谢、化学应激与氧化应激对细胞影响等。KEGG通路富集分析发现，黄葵胶囊对内分泌抵抗、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药机制、HIF-1信号通路、雌激素信号通路、磷脂酶D信号通路等多条通路具有调控作用。HIF-1是迄今发现的唯一一个缺氧状态下能特异性发挥活性的转录因子，由HIF-1α和HIF-1β 2个亚基组成，与微循环功能中的血管新生及炎症反应密切相关，可调节血管的生成，葡萄糖代谢及细胞的凋亡和自噬，HIF-1α表达增加可减轻糖尿病引起的肾脏结构和功能的改变，从而改善肾缺氧和蛋白尿，保护肾功能，体外实验表明激活HIF-1有助于减少肾小球系膜细胞炎症介质（趋化因子2/单核细胞趋化蛋白-1）和巨噬细胞的浸润[20-21]。雌激素特别是17β-雌二醇是由ERα和ERβ 2个亚基组成的转录因子，具有抗氧化，抗凋亡和抗炎等作用，并促进内皮细胞增殖和血管生成，雌激素水平的升高有助于改善DN血管内皮[22]。内分泌抵抗和磷脂酶D与DN发病关系具体作用机制尚不清楚，仍须进一步研究。

综上所述，本研究通过网络药理学的方法，初步探究了黄葵胶囊治疗DN的药理学机制。黄葵胶囊可能通过PIK3R1、PIK3CA、AKT1、SRC、ESR1等靶点作用于内分泌抵抗、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药机制、HIF-1信号通路、雌激素信号通路等多条信号通路发挥作用，为黄葵胶囊治疗DN的进一步研究提供了理论依据。

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（2021-05-27收稿本文編辑：王明）

基金项目：国家自然科学基金项目（81870495）;北京市自然科学基金项目（7202179）;中国健康促进基金会（DKD-MBD，2018-2022）作者简介：焦圆圆（1990.01—），女，博士研究生在读，研究方向：糖尿病肾病，E-mail：18801060951@126.com通信作者：李文歌（1966.12—），男，博士，教授，主任医师，研究方向：慢性肾脏病临床与科研，E-mail：wenge_lee2002@126.com13394B73-CB2C-4322-A0A1-5D8D25E41881