云南老人头菌多糖的提取及抗氧化活性研究

胡栋宝，王艳，杨猛，李琛

(玉溪师范学院 化学生物与环境学院，云南 玉溪 653100)

老人头菌，又名仙人头，主要分布于云南、四川、西藏等地，生长在云贵高原3000 m以上松杉木、油杉等针叶林中阴湿疏松的地上，目前人工无法培植, 是一种珍稀的野生食用菌。老人头菌洁白细嫩、滋味鲜美，含有丰富的蛋白质、氨基酸、矿物质及维生素，常被用作调味品。真菌多糖具有抗菌、抗病毒、抗凝血、降血脂、降血糖、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等多种生物活性[1]，在食品工业及调味品领域有着广泛的应用，例如：添加猴头菇辅料制成的黑木耳复合多糖口服液能够显著增强小鼠的免疫能力[2]；香菇多糖能提高人体内短链脂肪酸的含量，从而具有调节肠道菌群的能力[3]；鸡腿菇多糖、灵芝多糖具有较强的抗氧化及降血糖功效[4]。目前，尚未见有关老人头菌中多糖的提取及抗氧化活性的报道，为了进一步开发利用这种野生食用菌资源，本研究以云南产老人头菌为原料，在单因素实验的基础上结合响应曲面法优化其多糖的提取工艺，此外，采用体外清除DPPH自由基、ABTS+自由基及还原三价铁离子3种方法评价了老人头菌多糖提取物的抗氧化活性，将为老人头菌在调味品领域的开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与化学试剂

野生云南老人头菌：购自云南玉溪市野生菌市场，晒干粉碎后过60目筛，干燥备用；葡萄糖、浓硫酸、苯酚：天津市风船化学试剂科技有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾和三氯化铁：西陇科学股份有限公司；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)：美国Sigma公司；抗坏血酸：天津市双船化学试剂厂；ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐：成都艾科达化学试剂有限公司；无水乙醇：四川西陇化工有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.2 主要实验仪器

分析天平 上海奥豪斯仪器有限公司；超声清洗仪 上海声源超声波仪器设备有限公司；721可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司。

1.3 实验处理方法

1.3.1 老人头菌多糖的提取

准确称取0.5000 g老人头菌粉末，采用水提醇沉法超声提取，滤液中加入3倍体积的95%乙醇于4～8 ℃放置12 h醇沉，离心，得多糖沉淀，复溶定容到25 mL，得多糖溶液。

1.3.2 葡萄糖标准曲线的建立

精确称取0.0500 g葡萄糖标准品，溶解，定容至100 mL，移取10.00 mL定容至50 mL，加纯水稀释成0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。分别移取0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.70，0.90 mL浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液，加蒸馏水到2.00 mL，加1.00 mL 5%的苯酚溶液，加5.0 mL浓硫酸，摇匀，放置30 min，在波长490 nm处测定吸光度值，平行3次，绘制标准曲线，方程为y=54.013x+0.0045，相关系数R2=0.9992，线性拟合程度较好。

1.3.3 多糖得率的测定

取老人头菌多糖溶液0.10 mL，加纯水到2.00 mL，再加入1.00 mL 5%的苯酚溶液，加5.00 mL浓硫酸，混匀，静置30 min，在490 nm处测吸光值，由标准曲线计算老人头菌多糖提取率。

多糖提取率(%)=(C×V1×V2/V3×m)×100%。

(1)

式中：C为提取液中多糖的含量(mg/mL)；V1为比色液体积(mL)；V2为定容体积(mL)；V3为供试样品体积(mL)；m为实验样品质量(mg)。

1.4 单因素实验

称取0.5000 g样品，分别在液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，mL/g)、超声时间(10，20，30，40，50 min)、超声温度(30，35，40，45，50，55 ℃)、超声提取次数(1，2，3次)4种不同的实验条件下进行多糖的提取，参照多糖提取率测定方法进行测定，平行3次，计算得率[5]。

1.5 响应面实验分析

采用Box-Behnken方法进行四因素三水平实验设计，以老人头菌多糖提取率为指标，确定单因素中每个因素的最佳值后，进行响应面实验。实验因素与水平见表1。

表1 响应面实验设计Table 1 The response surface experiment design

1.6 抗氧化实验

1.6.1 清除DPPH自由基能力的测定

取2.0 mL不同浓度的老人头菌多糖溶液(0.1，0.3，0.5，0.7，0.9，1.1 mg/mL)于比色管中，加入2.00 mL无水乙醇，加入2.00 mL 0.02 mg/mL DPPH溶液，混匀，室温避光静置30 min，在517 nm处测定吸光度Ai[6]；以2.00 mL超纯水替代0.02 mg/mL DPPH溶液，测吸光度Aj；以超纯水替代多糖溶液测吸光度Ac，平行3次实验。用VC作阳性对照，计算DPPH自由基清除率，公式如下：

DPPH自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%。

(2)

1.6.2 清除ABTS+自由基能力的测定

取2.00 mL不同浓度的老人头菌多糖溶液(0.075，0.1，0.125，0.15，0.175，0.2 mg/mL)于比色管中，加入3.00 mL ABTS+工作液，摇匀，室温下避光放置6 min，在波长734 nm处测吸光度记为Ai，以3.00 mL无水乙醇替代ABTS+工作液测吸光度Aj，以2.00 mL无水乙醇替代多糖溶液测吸光度Ac，平行3次实验，以VC作阳性对照，计算ABTS+自由基清除率，公式如下：

ABTS+自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%。

(3)

1.6.3 还原Fe3+能力的测定

取2.00 mL不同浓度的老人头菌多糖溶液(0.075，0.1，0.125，0.15，0.175，0.2 mg/mL)，加入2.00 mL pH 6.6的磷酸缓冲溶液，再加入2.00 mL 1%铁氰化钾溶液，50 ℃水浴反应20 min，冷却后加入2.00 mL 10%三氯乙酸溶液，摇匀，取2.00 mL溶液加入2.00 mL超纯水，再加入0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，放置8 min,在700 nm处测吸光度，平行3次实验，以VC作为阳性对照。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1 液料比的选择

在超声时间30 min、超声温度50 ℃、提取次数2次的条件下，研究不同液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，mL/g)对老人头菌多糖提取率的影响，结果见图1。

图1 液料比对多糖提取率的影响Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on the extraction yield of polysaccharides

由图1可知，当液料比达到20∶1时，多糖得率达到最大，之后逐渐下降，其原因可能是水的用量较小时，老人头菌中的多糖溶解不够完全，从而得率较低；当水的用量过大时，提取出来的其他杂质的量随之增加，降低了多糖得率[7-8]。故选择液料比20∶1为最佳提取条件。

2.1.2 超声时间的选择

在液料比20∶1(mL/g)、超声温度50 ℃、提取次数2次的条件下，研究不同超声时间(10，20，30，40，50 min)对老人头菌多糖提取率的影响，结果见图2。

图2 超声时间对多糖提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of polysaccharides

由图2可知，超声时间在10～30 min内多糖得率逐步增加，30 min时达到峰值，之后多糖得率开始下降,可能是因为提取时间过短，多糖溶解不充分，但时间过长则可能会使多糖结构发生变化而使多糖得率降低。因此，最佳的超声时间选择30 min。

2.1.3 超声温度的选择

在液料比20∶1(mL/g)、超声时间30 min、提取次数2次的条件下，研究不同超声温度(30，35，40，45，50，55 ℃)对老人头菌多糖提取率的影响，结果见图3。

图3 超声温度对多糖提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the extraction yield of polysaccharides

由图3可知，超声温度在30～50 ℃内多糖提取率逐步增加，50 ℃时达到顶峰，之后多糖提取率下降，其原因可能是温度较低时多糖提取不充分，而温度过高会导致多糖结构发生改变[9-10]。故最佳超声温度选择50 ℃。

2.1.4 提取次数的选择

在液料比20∶1(mL/g)、超声时间30 min、超声温度50 ℃的条件下，研究老人头菌提取1，2，3次对老人头菌多糖提取率的影响，结果见图4。

图4 提取次数对多糖提取率的影响Fig.4 Effect of extraction times on the extraction yield of polysaccharides

由图4可知，当提取次数为2次时其多糖提取率达到最高，2次之后提取率开始下降，可见超声提取次数对老人头菌多糖提取率有着很大的影响。因此，最佳提取次数为2次。

2.2 响应面实验结果与分析

2.2.1 响应面实验设计结果

根据表1中的四因素三水平，生成29组实验，得到多糖提取率,结果见表2，对其结果进行多元回归拟合分析，得二次回归方程为：Y=+2.66+0.0683A-0.0550B+0.0233C+0.0717D-0.0125AB-0.0025AC+0.0100AD-0.0425BC+0.0100BD+0.0150CD-0.2464A2-0.3814B2-0.04539C2-0.4262D2。

表2 响应面实验优化设计结果Table 2 The response surface optimization scheme and test results

表3 响应面方差分析结果Table 3 Analysis of variance for the response surface quadratic model

续 表

由表3可知，模型的P<0.0001，非常显著，而失拟残差项的P=0.1488>0.05为不显著[11-12]，因此，该模型能用于老人头菌多糖提取的预测。在一次项A、B、C、D 4个影响因素中，D因素的F值最大，影响极显著，A、B、C次之，在二次项中C2极显著，A2、B2、D2显著。

2.2.2 响应面分析

响应面图越陡峭则显示该因素对其影响越明显，反之，越平坦则影响越不明显[13-14]，见图5～图8。

图5 液料比和超声时间对多糖提取率影响的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface plot and contour diagram of effects of liquid-solid ratio and ultrasonic time on the extraction yield of polysaccharides

图6 液料比和超声温度对多糖提取率影响的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface plot and contour diagram of effects of liquid-solid ratio and ultrasonic temperature on the extraction yield of polysaccharides

图7 液料比和超声提取次数对多糖提取率影响的响应面图和等高线图Fig.7 Response surface plot and contour diagram of effects of liquid-solid ratio and ultrasonic extraction times on the extraction yield of polysaccharides

图8 超声时间和超声提取次数对多糖提取率影响的响应面图和等高线图Fig.8 Response surface plot and contour diagram of effects of ultrasonic time and ultrasonic extraction times on the extraction yield of polysaccharides

由图5可知，超声时间变化曲面比液料比变化曲面陡峭，说明超声时间对老人头菌多糖提取率的影响更大；等高线呈椭圆形表明二者交互作用显著。由图6可知，液料比变化曲面比超声温度变化曲面平缓，说明液料比对老人头菌多糖提取率的影响较小。由图7可知，超声提取次数变化曲面比液料比变化曲面陡峭，说明提取次数对多糖提取率的影响较大。

2.2.3 优化与验证实验

依据以上响应面实验模型和结果，将多糖提取参数确定为：液料比20.701∶1(mL/g),超声时间29.243 min，超声温度50.151 ℃，超声提取次数2.086次；该实验参数下老人头菌多糖提取率为2.672%。应用至实际中，调整实验参数为：液料比21∶1(mL/g)，超声时间29 min，超声温度50 ℃，超声提取次数2次，老人头菌多糖得率为2.625%。

2.3 老人头菌多糖提取物体外抗氧化活性实验

2.3.1 DPPH自由基的清除能力

由图9可知，老人头菌多糖提取物和抗坏血酸对DPPH自由基的清除效果均随着浓度的升高而升高，当老人头菌多糖浓度为1.3 mg/mL时，清除率达到94.22%。

图9 不同浓度老人头菌多糖提取物与抗坏血酸对DPPH自由基的清除能力Fig.9 The scavenging activity of polysaccharide extracts fromCatathelasma ventricosum and ascorbic acids with different concentrations on DPPH free radicals

2.3.2 ABTS+自由基的清除能力

图10 不同浓度老人头菌多糖提取物与抗坏血酸对ABTS+自由基的清除能力Fig.10 The scavenging activity of polysaccharide extracts fromCatathelasma ventricosum and ascorbic acids with different concentrations on ABTS+ free radicals

由图10可知，老人头菌多糖提取物和抗坏血酸均能较好地清除ABTS+自由基，且两者的清除效果随着浓度的升高而增强，当其多糖浓度为0.2 mg/mL时，清除率达到90.29%。

2.3.3 还原Fe3+能力分析

图11 不同浓度老人头菌多糖提取物与抗坏血酸还原Fe3+能力Fig.11 The reducing activity of polysaccharide extracts from Catathelasma ventricosum and ascorbic acids with different concentrations on Fe3+

由图11可知，随着老人头菌多糖浓度的升高，吸光度不断增大，即还原力增强。老人头菌多糖与VC阳性对照，老人头菌多糖的总还原能力弱于VC。

3 结论

利用超声波提取老人头菌中的多糖，采取四因素三水平响应面分析方法探讨了4个因素对其多糖提取率的影响，得到老人头菌中多糖最佳条件为：液料比21∶1(mL/g)，超声时间29 min，超声温度50 ℃，提取次数2次。此外，研究了老人头菌多糖的抗氧化活性，随着其浓度的增加，其对DPPH、ABTS+自由基的清除作用增强，对Fe3+的还原能力也增强。