蓝蛤酶解液美拉德反应工艺优化及其对挥发性风味物质的影响

步营，韩梦琳,2，祝伦伟，朱文慧*，李学鹏*，位正鹏，励建荣

(1.渤海大学 食品科学与工程学院，辽宁 锦州 121013；2.大连工业大学 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 大连 116034；3.毕节市农业区划中心，贵州 毕节 551700；4.荣成泰祥食品股份有限公司 农业部冷冻调理海洋食品加工重点实验室，山东 荣成 246309)

蓝蛤(Aloididaealoidi)是一种盛产于我国沿海滩涂的小型低值贝类，主要作为对虾养殖的活饵料使用[1]。其肉质鲜美，富含优质蛋白，呈味氨基酸占氨基酸总量的50%左右，是生产海鲜调味料的理想原料[2]。近年来，以提取[3]、发酵[4]和酶解[5]等方式生产的海鲜调味料需求持续增长，其营养价值高、口感好、抗氧化性强、降胆固醇效果好[6]。其中酶解技术是一种实现海鲜调味料现代化生产的重要手段，但是酶解液一般苦腥味重、鲜味醇厚味较弱等问题严重限制将其开发为海鲜调味料的进程。在适宜的反应条件下，美拉德反应能产生一系列芳香物质，形成显著的香气并增强味觉[7]。

前期研究表明，超高压处理通过提高蛋白酶活性、破坏蛋白质结构来增加蛋白水解度，促进了呈味氨基酸、核苷酸、有机酸等风味物质的释放，改善了酶解液的风味[8]。本研究在前期研究的基础上，以蓝蛤超高压酶解液为研究对象，对美拉德反应进行工艺优化，以期对蓝蛤酶解液进行风味修饰，研发一种风味良好、天然营养、具有生物活性的海鲜调味料。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

鲜活蓝蛤：购于锦州林西路水产市场，购回实验室后进行吐沙处理并置于-40 ℃条件下保存待用。

FlavourzymeTM(500 LAPU/g)、NovozymTM11039(1.2 AU-A/g)：丹麦Novozymes公司；氢氧化钠(食品级)：滨化集团股份有限公司；D-木糖(食品级)：山东福田药业有限公司；L-半胱氨酸(食品级)：河北华阳生物科技有限公司。

1.2 主要仪器设备

UV-2550紫外可见分光光度计 日本岛津公司；PEN3电子鼻 德国Airsense公司；Agilent 7890N-5975C气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蓝蛤酶解液的制备

按照步营等[9]的方法进行酶解液的制备：将蓝蛤脱壳取肉，取蓝蛤肉加入去离子水(1∶1, W/V)后均质，分别添加FlavourzymeTM500MG(0.2%, W/V, 500 LAPU/g)和NovozymTM11039(0.2%, W/V, 1.2 AU-A/g)，用1.0 mol/L的NaOH溶液调pH为7.0，在250 MPa下高压处理1 h，置于50 ℃水浴锅中酶解4 h，酶解结束后100 ℃下灭活10 min。在4 ℃下以5120×g离心15 min，将上清液冷冻干燥后得到冻干粉，置于干燥器中备用。超高压处理所得冻干粉记为F1(超高压酶解物)；常压处理所得冻干粉记为F2(常压酶解物)。

1.3.2 美拉德反应单因素试验

以冻干粉(0.50 g)、D-木糖(0.20 g)和L-半胱氨酸(0.20 g)为原料，配制成10 mL的反应体系。以感官评价、风味中间体、电子鼻为指标来探究反应温度、反应时间以及初始反应pH值对美拉德反应产物的影响。

1.3.2.1 反应温度对美拉德反应产物的影响

取上述反应体系，调pH为6.5，分别在90，100，110，120，130 ℃下加热70 min，冷却至室温后进行评价。

1.3.2.2 反应时间对美拉德反应产物的影响

取上述反应体系，调pH为6.5，在110 ℃下分别加热60，70，80，90，100 min，冷却至室温后进行评价。

1.3.2.3 初始反应pH值对美拉德反应产物的影响

取上述反应体系，调pH为6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，分别在110 ℃下加热70 min，冷却至室温后进行评价。

1.3.3 美拉德反应正交试验

在单因素试验基础上，每个因素确定3个水平，以感官评分为试验指标，设计L9(34)正交试验优化各因素组合，以确定美拉德反应的最佳工艺参数。各因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal test factors and levels

1.3.4 低分子量风味中间体的测定

美拉德反应产物中低分子量风味中间体在波长294 nm处有最大吸收峰，A294nm越大风味越佳。用去离子水将美拉德反应产物稀释50倍后在294 nm处测定吸光度，重复3次。

1.3.5 感官评价

本试验挑选10名受过培训的食品专业人员(男女各半)组成感官评价小组，评价指标用腥味、肉香味、鲜味、苦味等来表示，对美拉德反应产物逐个进行评分，最终得出感官综合评分[10]，见表2。

表2 美拉德反应产物的感官评价标准Table 2 The sensory evaluation criteria for MRPs

1.3.6 电子鼻的测定

不同传感器性能描述见表3。

表3 电子鼻传感器性能描述Table 3 The performance description of electronic nose sensors

参照步营等[11]的方法稍作修改。移取5 mL美拉德反应产物于20 mL测试管中，用3层保鲜膜封口，50 ℃水浴30 min，生成顶空气体，有利于电子鼻探头吸取顶端空气。电子鼻参数设置：以洁净干燥空气为载气，测定时间120 s，气体流量300 mL/min，采样后清洗时间240 s，重复3次。

1.3.7 美拉德反应产物的制备

以最优反应条件，将F1和F2的美拉德反应产物分别记为MRPF1和MRPF2，未添加D-木糖和L-半胱氨酸的热反应产物作为阴性对照(F1NC和F2NC)，未加热反应作为空白对照(F1BC和F2BC)。

1.3.8 挥发性物质测定

采用HS-SPME-GC-MS法对样品中的挥发性化合物进行测定[12]，参照步营等的方法稍作修改。取5 mL样品于20 mL顶空瓶中，加入1 g NaCl和磁转子，迅速用聚四氟乙烯隔垫密封。60 ℃磁力搅拌加热平衡15 min后，使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头(280 ℃活化30 min)顶空吸附30 min，将萃取头插入气相色谱进样口，解吸5 min。

气相色谱条件：HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度250 ℃；载气为He，流速1.0 mL/min；不分流模式进样；程序升温：柱初温40 ℃，保持4 min，以5 ℃/min升至120 ℃，保持1 min，再以6 ℃/min升至250 ℃，保持6 min。

质谱条件：电离方式为电子轰击(EI源)，电子能量为70 eV；色谱-质谱接口温度280 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃；质量扫描范围30～550(m/z)。

所得GC-MS检测结果通过计算机NIST11谱库和人工检索处理，并利用C8～C20正构烷烃混标的保留时间计算各个色谱峰的保留指数(RI)，计算方式参照Xu等[13]的方法，确定挥发性物质的化学组成，统计匹配度大于60和RI偏差<20的挥发性物质，按峰面积归一化法计算各化学成分的相对含量。

1.3.9 数据分析

采用SPSS Statistics 19.0分析软件中的ANOVA程序进行显著性分析(P<0.05，表明差异显著)，数据绘图采用Origin 9软件。电子鼻数据通过自带的WinMuster软件进行主成分分析(principal component analysis, PCA)。

2 结果与讨论

2.1 美拉德反应单因素条件的确定

2.1.1 美拉德反应温度的确定

反应温度对美拉德反应的影响见图1。

图1 反应温度对美拉德反应的影响Fig.1 The effect of reaction temperature on Maillard reaction

由图1可知，当温度低于110 ℃时，美拉德反应不能充分进行，所得产物腥味较重，影响感官品质。随着反应温度升高，美拉德反应产物的腥味明显减弱，并产生浓郁的肉香味和醇厚味，感官品质在120 ℃时达到最佳(7.8分)，显著高于其他反应温度下的感官评分(P<0.05)。当反应温度继续升高时，由于温度过高而产生焦糊味和苦味，严重影响感官。研究表明，当反应温度过高时会产生羟甲基糠醛和丙烯酰胺等对人体有害的物质[14]；随着反应温度的升高，美拉德反应产物的A294nm呈递增趋势，即有利于美拉德反应的进行，该结果与孙世广[15]和伊小丽[16]的研究结果一致。综合来看，选择120 ℃为最佳反应温度进行后续试验。

不同反应温度的美拉德反应产物电子鼻响应值雷达图见图2中(a)，其中除传感器W1W(对硫化物灵敏)以外，其他的传感器对各组美拉德反应产物均有明显的响应，且不同反应温度的响应值存在差异。

由图2中(a)可知，随着反应温度的升高，W5S的响应值明显降低，W5C显著升高，说明醛类等氮氧化合物逐渐减少，并产生芳香类物质。该结果与感官评价时的结果相一致；为进一步分析不同反应温度下美拉德反应产物风味的区别，对其进行PCA分析，其结果见图2中(b)。

图2 不同反应温度的美拉德产物的电子鼻响应值雷达图(a)和主成分分析图(b)Fig.2 Electronic nose response value radar diagram (a) and principal component analysis diagram (b) of Maillard reaction products at different reaction temperatures

由图2中(b)可知，PC1为90.56%，PC2为8.32%，贡献率总和为98.88%，说明可代表样品挥发性风味的主要特征。从空间分布上看，除了反应温度为90 ℃和100 ℃的美拉德反应产物气味略有重叠，其他区分度良好，说明样品间的气味存在差异。发生重叠的原因可能是反应温度较低，导致美拉德反应产物气味相似。

2.1.2 美拉德反应时间的确定

反应时间对美拉德反应的影响见图3。

图3 反应时间对美拉德反应的影响Fig.3 The effect of reaction time on Maillard reaction

由图3可知，随着反应时间的延长，美拉德反应产物的感官评分呈递增趋势。当反应时间为60 min和70 min时，美拉德反应产物有腥味和苦涩感，无明显肉香味，且感官协调性较差。随着反应时间延长至90 min，美拉德反应产物的腥味减弱，苦涩味无明显变化，肉香味明显，整体协调性更佳。反应时间为100 min与90 min的感官评分无显著差异(P>0.05)。综合来看，选择100 min为最佳反应时间进行后续试验。

图4 不同反应时间的美拉德产物的电子鼻响应值雷达图(a)和主成分分析(b)Fig.4 Electronic nose response value radar diagram (a) and principal component analysis diagram (b) of Maillard reaction procucts at different reaction time

不同反应时间的美拉德反应产物电子鼻响应值雷达图见图4中(a)。除传感器W1W外，其他的传感器对各组美拉德反应产物均有明显的响应，变化趋势与上述反应温度的影响效果一致，但变化幅度低于温度的影响。

由图4中(b)可知，PC1为80.88%，PC2为11.92%，贡献率总和为92.80%，能较好地代表美拉德反应产物中挥发性风味的主要特征。从空间分布上看，反应时间为70，80，90 min的美拉德反应产物相互重叠，可能是该反应时间段内样品的变化程度小，三者气味成分相似度高。

2.1.3 美拉德反应初始pH的确定

图5 pH值对美拉德反应的影响Fig.5 The effect of pH value on Maillard reaction

美拉德反应体系的初始pH能够影响美拉德反应的进行，pH值过低或过高都会使产物产生不愉快的感官印象。由图5可知，美拉德反应产物的感官评分和A294 nm随着pH的变化先增大后减小。当反应液为酸性时，美拉德反应产物的增香效果不明显。原因可能是在酸性环境下氨基被质子化，主要发生1,2-稀醇化反应，生成糠醛等物质[17]，而具有良好风味的物质较少。pH为7.0时美拉德反应产物的评分最高，此时A294 nm最大，即低分子质量风味中间体最多。随着pH变为碱性，反应变得剧烈且不易控制，感官评分和A294 nm开始降低，因此选择pH 7.0为最佳初始pH进行后续试验。

不同反应pH值的美拉德反应产物电子鼻响应值雷达图见图6中(a)。

由图6中(a)可知，与反应温度和时间相比，不同pH值的响应值均较小，并且强度变化微小，这表明当pH在6.0～8.0范围内变化时，对美拉德反应产物的气味方面影响较小，结合感官评价分析可知，pH变化主要影响了美拉德反应产物的滋味。

由图6中(b)可知，PC1为99.21%，PC2为0.44%，贡献率总和为99.65%，能代表样品挥发性风味的主要特征。每组样品测定数据均能成团并且形状圆整，表明试验重复性良好。同时各组样品在空间分布上距离较为紧密，表明样品间气味差别较小。

图6 不同反应pH值的美拉德产物电子鼻响应值雷达图(a)和主成分分析(b)Fig.6 Electronic nose response value radar diagram (a) and principal component analysis diagram (b) of Maillard reaction products at different reaction pH values

2.2 美拉德反应正交试验结果

表4 正交试验设计结果Table 4 The design results of orthogonal test

由表4可知，影响蓝蛤酶解液美拉德反应产物感官品质的因素主次顺序依次为A>B>C，即反应温度>反应时间>初始pH值。比较均值k的大小可以得出美拉德反应条件的最佳组合为A2B1C2，即反应温度为120 ℃，时间为90 min，初始pH为7.0，在此条件下制备的美拉德反应产物无腥味并且肉香味浓郁，整体协调性好(感官评分为8.5)。

2.3 挥发性物质分析

表5 气相色谱-质谱法检测美拉德反应后酶解产物挥发性成分的变化Table 5 Changes of volatile compounds of enzymatic hydrolysate after Maillard reaction detected by GC-MS

续 表

续 表

续 表

在一定程度上，样品的风味特征取决于挥发性化合物的组成和含量。由表5可知，根据它们的一般性质和化学结构，共鉴定出139种挥发性化合物并将其分为11个类别，包括醛类、酮类、醇类、芳香族化合物、酯类、酸类、酚类、烃类、呋喃类、含硫化合物、含氮化合物。

醛类主要是由不饱和脂肪酸氧化或氨基酸降解产生的，一般具有水果、青草、脂肪和腥味气味特征，并且具有较低的气味活性值(odour activity value, OAV)，因此即使微量也能表现出其独特的风味。在本研究中，醛类是酶解液最主要的挥发性化合物，而其他研究也表明醛类是水产品中最主要的风味物质[18-19]。空白对照组中醛类的相对含量(F1BC:30.32%,F2BC:21.69%)高于阴性对照组(F1NC:27.95%,F2NC:22.66%)和美拉德反应产物(MRPF1:1.80%,MRPF2:1.17%)。该结果表明，随着美拉德反应的进行，醛类的相对含量明显下降，这与Zhao等的研究一致。

总共检测出16种酮，它们有脂肪和坚果的良好风味。但是，酮类的相对含量较低并且具有高气味阈值，因此对风味贡献较小。醇类主要来源于多不饱和脂肪酸的降解或羰基化合物的还原，一般来讲，由于醇类的感官阈值高，风味贡献较小。1-辛烯-3-醇是不饱和醇，由于其OAV低，因此对样品风味有较大贡献。一些研究发现，1-辛烯-3-醇广泛存在于贝类中，是贝类的特征风味物质[20]。芳香族化合物主要是通过芳香族氨基酸的分解代谢产生。此外，还发现了一些酯类、酸类、烃类和酚类物质，由于其OAV较高，通常对样品的风味没有影响。

共检出13种呋喃化合物，有研究表明，呋喃是氨基酸热降解而形成的[21]。呋喃类及其衍生物可贡献出肉味、咖啡味和焦香味等香味，并且因极低的OAV而显著影响食品的风味。呋喃类物质在F1BC、F2BC、F1NC、F2NC、MRPF1、MRPF2中的相对含量分别为0.78%、0.22%、9.67%、5.02%、32.61%、22.93%。这些结果表明，加热美拉德反应后呋喃含量明显增加，反应体系中L-半胱氨酸和D-木糖的加入促进了呋喃的形成。

共检测到18种含硫化合物，是提供肉香味、烧烤味和牛肉风味的重要风味物质，其呈味特性好且OAV低。由表5可知，美拉德反应前含硫化合物的相对含量低于0.21%，而反应后其种类和相对含量明显增大(大于6.82%)。此外，还检出13种含氮化合物，它们是引起熟食烘焙、花生、牛肉、可可味的挥发性物质，具有极低的气味阈值。在本研究中，美拉德反应后F1中含氮化合物的相对含量从0.00%增加到6.26%，这是热诱导的碳水化合物降解产物和氨基酸的Strecker产物之间反应导致的。

3 结论

本文以蓝蛤超高压酶解液为原料，采用美拉德反应对酶解液的风味进行改良。在单因素试验的基础上，采用正交试验设计对反应的各个条件进行优化试验。结果表明，反应温度对酶解液气味的改变影响最大，电子鼻技术能良好地将其区分。最优工艺条件为反应温度120 ℃、时间90 min、初始pH 7.0，在此条件下制备的美拉德反应产物无腥味并且肉香味浓郁，整体协调性好。此外，HS-SPME-GC-MS结果表明，酶解液的挥发性化合物在美拉德反应前后发生变化，具有腥味特征的醛类明显降低，具有肉香味的呋喃和含硫化合物含量增加。由此可见，蓝蛤超高压酶解液通过美拉德反应可以明显地改善其风味。