驴乳发酵乳源的植物乳杆菌L28鉴定及其对小鼠肠道菌群的影响

张 奇，肖会姣，武丽辉，贾 薇

1 北京城市学院生物医药学部，北京 100094

2 中驭（北京）医学研究院，北京 101102

3 农业农村部农药检定所，北京 100125

0 引言

人类肠道内存在上千种、数以亿计的微生物，它们参与了人体多种物质代谢，并与人体健康密切相关。研究发现，疾病的发生通常伴随着肠道微生态的改变，这越发引起了人们的关注。在某些因素致肠道微生态失衡的情况下，益生菌对肥胖[1]、糖尿病[2]、炎症性肠病[3]、肿瘤[4]、动脉粥样硬化[5]、骨质疏松[6]、代谢综合征、非酒精性脂肪肝及过敏反应等的发生具有潜在地促进作用[7]。

抗生素临床治疗感染性疾病时，对患者的肠道微生物有多种不良影响，如减少有益微生物的数量、促进潜在致病菌的定植、刺激细菌产生抗药性、稳定微生物抗药性等[8]，进而导致患者肠道菌群的组成和功能发生改变，从而影响健康。

我国益生菌资源丰富，尤其是牧民传统自制乳制品，可作为益生菌的宝贵来源，探索新发现的源于自然发酵乳制品的益生菌的功能具有一定的意义。前期研究表明，驴乳具有显著的肠道微生态调理功能，其作用可能与其富含益生菌有关。本研究首先对从新疆驴乳发酵乳中筛选的菌种L28进行鉴定，然后以抗生素致小鼠肠道菌群失调模型为实验动物，以L28为微生态调节剂，低聚果糖为阳性对照物，采用平板计数法测定干预前后肠道内肠杆菌、乳酸菌的含量和比例变化，并通过16S rDNA扩增子测序技术，分析干预前后模型动物肠道菌群的多样性，确证植物乳杆菌L28对肠道调理的益生功能。

1 材料与方法

1.1 试验材料

SPF级KM小鼠25 只，雄性，体重18～22 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司（SCXK（京）2016-0011）；盐酸林可霉素（货号：L8390）、头孢唑啉钠（货号：C9680）、氨苄西林钠（货号：A8180）、低聚果糖（货号：F8370），购于北京索莱宝科技有限公司；MC、MRS、VABR培养基，购于北京陆桥技术股份有限公司；菌种L28，从新疆牧民自制传统驴乳发酵乳中筛选获得，产酸、接触酶阴性、革兰氏染色阳性、杆状；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 L28的培养

取保存的L28菌种，MRS平板活化，挑取单菌落，MRS肉汤37 ℃培养24 h，将培养液离心去上清，PBS（0.02 mol/L，pH7.4）洗涤菌体2 次，然后将菌体分散于PBS中，配制浓度分别为1.0×105CFU/mL和1.0×109CFU/mL的菌液。

1.2.2 L28菌种鉴定

将上述菌种培养物进行碳水化合物鉴定（API50CH）。同时对其16S rDNA和pheS基因进行测序、分析、比对。

1.2.3 肠道菌群失调动物模型的建立

随机选取20 只KM小鼠，无菌条件下采集粪便，随后灌服抗生素溶液（以无菌生理盐水配制的盐酸林可霉素、头孢唑啉钠及氨苄西林钠的混合液，3 种抗生素的终浓度均为20 mg/mL，0.2 mL/只，每天2 次，连续3 天，然后收集灌胃小鼠粪便，采用平板计数法对乳酸菌和肠杆菌进行检测，以乳酸菌菌落数显著降低且降低程度高于肠杆菌为模型建立成功标准[9]。

1.2.4 分组及干预

将抗生素处理过的20 只小鼠随机分为4 组，每组5 只：A组（模型自然恢复组，以PBS灌胃）、B组（L28低剂量组，1.0×105CFU/mL）、C组（L28高剂量组，1.0×109CFU/mL），D组（低聚果糖阳性对照组，100 mg/mL的低聚果糖生理盐水溶液），0.2 mL/只，每天2 次，连续6 天；未经抗生素处理的5 只小鼠作为空白对照组（E组）。

1.2.5 粪便采集及微生物计数

于灌胃前（第0天）、灌胃3 天后（第3天）和灌胃6 天后（第6天）无菌采集小鼠粪便，经稀释后选择适当的稀释度，分别涂布MC和VRBA培养基，37 ℃培养48 h后计数.

1.2.6 微生物多样性分析

为了进一步证明L28对小鼠肠道紊乱模型肠道微生态的改善作用，在无菌条件下收集模型自然恢复组、空白对照组、低聚果糖阳性对照组以及高、低浓度L28干预组6 天后的实验小鼠粪便，委托北京博云华康基因科技有限公司对粪便中的16S rDNA进行测序，并进行微生物菌群多样性分析。

1.2.7 统计方法

以Excel对各组动物肠道菌群进行分析，计算x±s，比较各组之间差异。

2 结果与分析

2.1 菌种鉴定

将L28菌接种于37 ℃培养后，进行碳水化合物利用研究（表1）；同时，进行16S rDNA和pheS基因测序，基因序列见表2，经序列同源性比对，结果表明，L28菌株与Lactobacillus plantarumWCFS1（Sequence ID： NC_004567.2）的同源性达99%，结合理化性质、碳水化合物利用，对比伯杰氏手册，综合鉴定菌株L28为植物乳杆菌。

表1 菌种L28 碳源利用鉴定

2.2 动物模型构建

无菌条件下收集20 只小鼠抗生素灌胃前后的粪便，以平板计数法检测灌胃前后粪便中的乳酸菌和肠杆菌的变化，经抗生素灌胃后，小鼠肠道中乳酸菌与肠杆菌含量均显著降低（p＜0.01），且抗生素灌胃小鼠粪便中乳酸菌含量降低更多，降低比例显著高于肠杆菌，根据模型判断标准，判断模型建立成功（表3）。

表3 肠道紊乱模型构建（x±s，log CFU/g，n=20）

2.3 益生菌对肠道微生态干预

分别对0 d、3 d和6 d各组动物肠道内乳酸菌和肠杆菌进行平板计数，结果见图1，不同剂量乳杆菌灌胃组（B、C）及阳性对照组（D）与模型自然恢复组（A）相比，3 d和6 d时肠道中的乳酸菌和肠杆菌均有显著提升，与干预时间正相关（p＜0.01），6 d时，高剂量植物乳杆菌L28干预组的小鼠肠道内乳酸菌恢复更快，含量可达正常空白对照组水平，与之相比无显著差异（p＞0.05），且存在剂量依赖关系。

图1 植物乳杆菌L28对肠道内乳酸菌和肠杆菌的影响

2.4 16S rDNA测序分析

收集模型自然恢复组、低、高浓度植物乳杆菌L28组、阳性对照组、空白对照组6 d后的小鼠粪便，测序分析其肠道微生物多样性，组间Alpha多样性如图2所示，经L28和低聚果糖干预后，observed species、Chao、ACE以及Shannon 指数提高，Simpson 指数下降，表明小鼠肠道菌群多样性显著提升，植物乳杆菌L28具备显著的改善肠道微生态功能。

图2 组间Alpha多样性盒形图

3 讨论

根据文献报道选择致肠道紊乱的抗生素种类[9]，同时调整抗生素终浓度至20 mg/mL，灌胃KM小鼠，建立肠道菌群紊乱小鼠模型，经检测，灌胃抗生素小鼠粪便中肠杆菌与乳酸菌均由1.0×108CFU/g降至约1.0×104CFU/g，且乳酸菌下降更多，含量低于肠杆菌，适合于肠道微生态干预恢复研究。

肠道微生态与人体健康密切相关，在某些因素致肠道微生态失衡的情况下，可导致多种疾病发生或提升患病风险[7]。抗生素治疗对宿主肠道微生物有诸多不良影响，如减少有益微生物的数量、促进潜在致病菌的定植、刺激和稳定细菌对抗生素的抗药性等[8]。因此，抗生素使用后，采用益生菌制剂加速肠道微生态恢复对于机体健康而言具有重要意义。

本研究对从新疆牧民传统自制驴乳发酵乳中筛选获得的潜在菌种L28进行菌种鉴定，确认其分类地位为植物乳杆菌——国家卫健委可食用菌种目录之一。随后采用抗生素致小鼠肠道紊乱模型，在肠道菌群被破坏的情况下灌服L28，3 d后肠道内乳酸菌显著恢复，6 d恢复至正常水平。为了证明模型小鼠肠道内乳酸菌恢复为肠道功能恢复，不是因植物乳杆菌L28灌服提升了乳酸菌总体含量，进一步采用16S rDNA测序技术对各组小鼠的肠道菌群多样性进行分析，综合比较observed species、Chao、ACE、Shannon及Simpson 指数变化，结果显示干预后小鼠肠道菌群多样性显著提升，L28菌株具备显著的改善抗生素致肠道紊乱小鼠模型的肠道微生态。