白细胞介素-1受体2型与c-Fos相互作用促进结肠癌细胞增殖、侵袭和血管新生

李雷，张晨嵩，潘成武，杜军，陈玉忠，马家驰

（蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科综合病区，安徽 蚌埠 233004）

结肠癌为世界上第四大最常见的癌症［1］，其中炎症参与了结肠癌进展的整个过程［2］。白细胞介素1（IL-1）信号传导是炎症性疾病调控的关键因素，并且是肿瘤生长、侵袭、血管生成和肿瘤与宿主相互作用的关键途径［3］。IL-1 受体包括IL1R1 和IL1R2。IL1R1 参与外源IL-1 的 信号 转导；而IL1R2 是诱饵受体，缺乏胞质信号传导域并阻断IL-1信号传导［4］。因此，IL1R2与IL-1受体拮抗剂相似，可作为IL-1 信号的负调节剂［5］。血管生成是许多生理和病理过程所需的基本过程，其受促血管生成因子和抗血管生成因子之间的平衡调节［6］。血管生成是肿瘤生长、侵袭和转移的关键步骤，原发肿瘤的扩展和转移到其他器官的转移都显著依赖［7］。许多因素在血管生成中起着重要作用，例如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、VEGF 受 体2 （VEGF receptor 2，VEGFR2）、缺氧诱导因子-1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）［8］。研究表明c-Myb 通过c-fos 诱导的上皮间质转化促进结肠癌细胞的恶性进展［9］。本研究旨在明确IL1R2 与c-Fos 相互作用后如何进一步影响结肠癌细胞的增殖、侵袭和血管新生。

1 材料与方法

1.1 组织样本和细胞来源 选择2018年1月至2019年12月在我院行手术治疗的60例结肠癌患者为研究对象，患者年龄35～82岁，平均（67.31±7.62）岁；男39例，女21例；部位：右半结肠26例，横结肠6例，左半结肠18例，乙状结肠10例；肿瘤最大径：≤5 cm 39例，＞5 cm 21例；浸润深度：T1 28例，T2 16例，T3 11例，T4 5例；分 化 程度：高分化26例，中分化24例，低分化10例；临床分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期21例，Ⅲ期14例；淋巴结转移：无21例，有39例。本研究经蚌埠医学院第一附属医院机构审查委员会批准，同时60例被采集样本组织的患者签署了知情同意书。人结肠癌细胞株SW620 购自中国科学院典型细胞培养物保藏中心。

1.2 Western blot 法检测结肠癌组织及癌旁组织IL1R2 和c-Fos 的表达 收集结肠癌组织及癌旁组织的细胞裂解物，并使用放射免疫沉淀缓冲液提取蛋白质，转移至聚偏二氟乙烯膜（美国Thermo Fisher 科技公司）之前，使用10%或15% SDSPAGE分离总蛋白（50µg）。在室温（25 ℃）下用脱脂牛奶将膜封闭1 h。随后将膜与IL1R2 一抗（1∶500） 或c-Fos 一抗（1∶500）（美国Santa Cruz 公司）分别在25 ℃孵育2 h，与二抗（1∶2 000，美国Santa Cruz 公司）在37 ℃孵育1 h，随后用带有Tween 20 的Tris 缓冲盐水洗涤3 次。使用增强的化学发光进行可视化，并使用Quantum One软件版本4.62，通过光密度法对信号进行定量。β-actin作为内参照。该实验独立重复3次。

1.3 细胞培养 将人结肠癌细胞株SW620在含有10%胎牛血清（FBS，美国Gibco 公司）、100 μg/ml 青霉素（德国Sigma-Aldrich 公司）的RPMI 1640 培养基中单层培养。IL1R2 模拟物（IL1R2 mimic）和抑制剂（IL1R2 inhibitor）由上海吉玛制药技术有限公司合成。孵育20 h 后，根据说明书，使用LipofectamineTM 2000 （美国Thermo Fisher 科技公司），用IL1R2 mimic和inhibitor转染结肠癌SW620 细胞，制备完成的细胞株供后续实验使用。

1.4 双重荧光素酶测定IL1R2 与c-Fos 的3′-UTR间的靶向关系 将SW620 细胞接种在96 孔板中。温育24 h后，将细胞与c-Fos-WT或c-Fos-MUT 和IL1R2 mimic 或阴性对照模拟物共转染。转染后48 h，根据说明书使用双重荧光素酶测定系统测定细胞。独立重复3次。

1.5 实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）法检测IL1R2 不 同 转 染 组IL1R2 和c-Fos的mRNA 表达 RT-PCR 热循环是在20 μl 反应溶液中进行的，其中包含2.5 μl cDNA，200 nm 每个引物和6.5 μl SYBR GreenⅠ主混合物，使用Roche Light Cycler 480 序列检测系统。IL1R2、c-Fos、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物序列由生工生物工程（上海公司提供），IL1R2 上游引物：5′-GCAGCTTGTGTGTGTGACTG-3′，下游引物：5′-CAGTCACACACACAAGCTGC-3′；c-Fos上游引物：5′-AGCATGGGCTCCCCTGTCA-3′，下游引物：5′-GAGACCAGAGTGGGCTGCA-3′；GAPDH上游引物：5′-CCTCGTCTCATAGACAAGATGGT-3′，下游引物：5′-GGGTAGAGTCATACTGGAACATG-3′。目的基因的表达水平相对于内参照GAPDH进行了标准化。

1.6 CCK8 法测定细胞增殖 使用CCK8 试剂盒（美国Dojindo Molecular Technologies，Inc.）检测人结肠癌SW620 细胞的增殖作用。收获处于对数生长期的人结肠癌SW620细胞，并在96孔板中以100 µl的体积进行培养。用对照、IL1R2 mimic和IL1R2 inhibitor 处理细胞，并在37 ℃孵育0、12、24 和48 h。使用Multiskan EX酶标仪（Thermo Fisher Scientific，Inc.）测量450 nm 波长处的光密度。

1.7 酶联免疫吸附（ELISA）法测定人结肠癌SW620细胞培养上清液中VEGF、VEGFR2、HIF-1α和bFGF的表达水平 ELISA试剂盒购自南京道斯夫生物科技有限公司。将人结肠癌SW620 细胞（5×105个细胞/孔）接种到6 孔板中，用10% FBS培养24 h，在低血清培养基（0.5%，v/v）中再培养12 h。将100 μl 样品添加到涂有抗体的96 孔板的每个孔中，在室温下孵育2 h。将100 μl 的工作检测器溶液加载到每个孔中，并将板在室温下再孵育1 h，添加100 μl 的底物溶液。通过添加50 μl 终止溶液来终止反应。在450 nm 波长下读取光密度。

1.8 Transwell 法检测细胞侵袭 将用对照、IL1R2 mimic 和IL1R2 inhibitor 处理的3 组细胞重悬于无血清RPMI 1640 培养基中，将各组细胞悬浮液（100 μl包含1×104个细胞/孔）接种到24孔培养箱的过滤器中；将明胶（10 μg/ml）添加到Transwell 板的每个孔（美国Corning-Costar 产品，孔径为8 μm）中，将膜在37 ℃下干燥1 h。此后，将悬浮在100 μl 无FBS 培养基中的5×103细胞接种到Transwell 板的上室中。下腔室充满含5% FBS 的培养基。温育8 h 后，用棉签除去Transwell 上膜顶部的细胞。用甲醇固定在膜底侧的细胞，并用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚溶液（10 μg/ml，美国Invitrogen公司）染色20 min。在荧光显微镜下计数来自每个膜的8 个不同视野的细胞数目。

1.9 统计学方法 采用GraphPad Prism 5 软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差表示，2 组比较采用t检验；多组比较采用单因素方差分析，其中两两比较采用LSD-t检验；重复测量资料比较采用重复测量资料的方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL1R2 和c-Fos 在结肠癌组织中的表达升高 Western blot 结果显示，IL1R2和c-Fos在结肠癌组织中的表达水平分别为1.93±0.25、1.88±0.20，明显高于癌旁组织（1.05±0.13和1.12±0.12）（t=6.318、4.255，P<0.05），见图1。

图1 Western blot法检测IL1R2和c-Fos在结肠癌组织及癌旁组织中的表达

2.2 荧光素酶测定IL1R2和c-Fos靶向作用 荧光素酶测定结果显示，IL1R2 mimic组c-Fos-WT荧光素酶活性为0.39±0.08，明显低于对照组（1.01±0.15）（t=6.823，P<0.05），而2组c-Fos-MUT荧光素酶活性分别为0.97±0.10和1.02±0.14，差异无统计学意义（t=7.819，P>0.05）。

2.3 RT-PCR 法检测IL1R2 不同转染组IL1R2 和c-Fos的mRNA 表达 RT-PCR 结果显示，与对照组比较，IL1R2 mimic 组IL1R2 和c-FosmRNA 表达升高（P<0.01），而IL1R2 inhibitor 组IL1R2 和c-FosmRNA表达降低（P<0.05），见表1。

表1 IL1R2不同转染组中IL1R2和c-Fos mRNA的表达水平（±s）

表1 IL1R2不同转染组中IL1R2和c-Fos mRNA的表达水平（±s）

注：与对照组比较，1）P<0.01，2）P<0.05

组别对照组IL1R2 mimic组IL1R2 inhibitor组F P IL1R2 mRNA 1.81±0.22 3.81±0.341）1.09±0.112）15.271 0.021 c-Fos mRNA 1.91±0.27 5.37±0.311）1.09±0.182）16.588 0.007

2.4 CCK8 法检测细胞增殖 CCK8 检测结果显示，经重复测量资料方差分析，组别（F=15.680，P<0.05）、时间（F=232.750，P<0.05）、组别与时间的交互作用（F=8.216，P<0.05）差异均有统计学意义。与对照组比较，IL1R2 mimic组12 h、24 h和48 h的细胞增殖升高（P<0.05），而IL1R2 inhibitor组12 h、24 h 和48 h 的细胞增殖降低（P<0.05）。见表2。

表2 CCK8法检测细胞增殖（±s）

表2 CCK8法检测细胞增殖（±s）

注：与对照组比较，1）P<0.05，2）P<0.05

组别对照组IL1R2 mimic组IL1R2 inhibitor组F P 0 h 43.10±5.41 47.34±7.29 44.13±4.52 2.890 0.110 12 h 108.73±10.23 164.26±13.191）88.43±6.342）12.762 0.024 24 h 177.32±65.15 274.66±38.251）124.34±35.412）15.481 0.012 48 h 231.71±75.13 355.45±39.311）146.14±41.532）17.628 0.009

2.5 Transwell 侵袭分析 Transwell 结果显示，3组比较差异有统计学意义（F=5.134，P=0.020），与对照组（137.82±26.14）比较，IL1R2 mimic 组细胞侵袭数量（354.23±12.12）增加（P<0.01），而IL1R2 inhibitor 组细胞侵袭数量（93.26±21.44）降低（P<0.05），见图2。

图2 Transwell侵袭实验检测不同组别穿透滤过膜的细胞数量（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染色×200）

2.6 ELISA 检测血管生成因子的水平 ELISA 检测结果显示，与对照组比较，IL1R2 mimic组VEGF、VEGFR2、HIF-1α和bFGF表达水平升高（P<0.05），而IL1R2 inhibitor 组VEGF、VEGFR2、HIF-1α 和bFGF表达水平降低（P<0.05），见表3。

表3 ELISA检测血管生成因子的表达水平（±s，pg/ml）

表3 ELISA检测血管生成因子的表达水平（±s，pg/ml）

注：与对照组比较，1）P<0.05，2）P<0.05

组别对照组IL1R2 mimic组IL1R2 inhibitor组F P VEGF 64.73±12.56 92.39±11.491）38.08±8.422）15.334 0.009 VEGFR2 62.32±18.01 85.37±6.021）40.29±12.012）16.352 0.023 HIF-1α 54.37±14.30 76.83±4.241）32.03±10.892）11.341 0.012 bFGF 42.52±9.89 68.49±3.141）20.45±6.392）14.263 0.019

3 讨论

结肠癌病理生理过程涉及多种因素，其中炎症在肿瘤血管生成中起着重要的作用。IL1R2表达在用IFN-γ或佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯处理的角质形成细胞中得到增强，表明IL1R2 起到促炎因子的作用［10］。最近的研究表明，细胞内IL1R2 的过表达增强了IL-6 的表达，因此，IL1R2在IL-1 信号传导的调节中具有明显的双重作用，即IL1R2抑制外源IL-1信号传导，而细胞内IL1R2刺激炎性细胞因子的表达［11］。IL1R2 的促炎活性不仅限于结肠癌细胞，还可以在致瘤性人类角质形成细胞中发现［12］。因为已在多种肿瘤中观察到IL1R2表达增强，所以我们可以推断IL1R2在驱动肿瘤进展中发挥重要功能。

c-Fos 能够调控肿瘤增殖、侵袭、血管生成、分化和凋亡等多个方面。其中，在细胞增殖方面，c-Fos 的外源表达能够使cyclinD 和cyclinE 的表达失调，加速凋亡S 期的进入［13］。不同功能的发挥和c-Fos不同下游基因的调控有密切关系。相关文献报道了与c-Fos 相互作用的蛋白。例如，c-Fos 与CBFA1 相互作用以激活胶原酶3 启动子，而HBXIP（乙型肝炎X 相互作用蛋白）的核输入依赖于HBXIP和c-Fos之间的相互作用以及这两者的磷酸化乳腺癌细胞中的蛋白质［13］。PRDM1过表达通过抑制c-Fos的表达减弱膀胱癌的进程［14］。本研究结果表明，比较结肠癌与癌旁正常组织后发现，结肠癌组织中IL1R2 与c-Fos 蛋白表达水平较癌旁正常组织明显升高，结合双重荧光素酶测定结果，进一步说明IL1R2 和c-Fos 之间存在相互作用关系。

VEGF 被认为是介导血管生成的最重要因素，其水平可以反映血管生成的状态［15］。因此，在过去的十年中，已经通过抑制VEGF 的表达来抑制血管新生。VEGFR2作为VEGF的受体，通过结合VEGF而发挥功能［16］。HIF-1在促进恶性细胞化疗耐药、肿瘤转移、血管生成、免疫抑制和细胞间相互作用中发挥重要作用，其可以调节血管生成相关因子的表达，从而介导血管生成过程［17］。bFGF是另一种与VEGF 相互作用的血管生成诱导剂［18］。本研究通过ELISA 检测结果显示，抑制IL1R2 表达后下调了VEGF、VEGFR2、HIF-1α 和bFGF这些促血管生成因子的表达。

综上所述，本研究明确了IL1R2 和c-Fos 在结肠癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织。通过调控IL1R2 的表达直接作用于c-Fos，进而影响结肠癌细胞的增殖、侵袭和血管新生，影响结肠癌细胞的发生和进展。由于结肠癌SW620 细胞并不能完全代表其他类型的结肠癌细胞系，体外细胞实验亦不能够完全模拟体内生理生化环境，因此该实验也存在一定的局限性。