NMR和GC-MS研究加热对奶油主要成分及香气化合物的影响

叶婷婷，刘思佚，刘 洁，杨晓莹，赵子建，陈德慰

（广西大学轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004）

奶油是以未均质化前的生牛乳为原料，分离含脂部分的一种淡黄色半固体食品。奶油中的脂质主要为甘油三酯，在总脂质中的含量超过98%，主要碳水化合物为乳糖，是由单糖葡萄糖和半乳糖组成的二糖。淡奶油中乳糖含量为3.7%～4.0%，而脂肪含量较高的鲜奶油中乳糖含量为2.8%～3.0%。奶油中的氨基酸含量约2.6%，其中以天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸和酪氨酸含量较高。

奶油中的关键香气物质已被广泛报道，香气活性物质主要来自脂类的水解和氧化反应，以及氨基酸参与的美拉德反应。在奶油关键香气物质中，丁酸、-癸内酯、-十二内酯和2-庚酮分别呈黄油味、蜜桃味和蓝纹芝士等香气特征；(,)-2,4-癸二烯醛和1-辛烯-3-酮分别表现出脂肪味和类似蘑菇、金属的气味；2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、甲基吡嗪、糠醛和麦芽酚分别表现出巧克力味、烘烤味、焦糖味和甜味。在这些化合物中，短链脂肪酸、内酯和甲基酮来源于饱和脂肪酸；不饱和醛和1-辛烯-3-酮来自不饱和脂肪酸的氧化；2-甲基丁醛和3-甲基丁醛来自Strecker降解；烷基吡嗪、呋喃和麦芽酚不仅可以由美拉德反应生成，也可以由焦糖化反应生成。

核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技术因其快速方便、准确且专属性强的优点，已被广泛用于乳制品领域，近年来常用于乳制品中碳水化合物、氨基酸、脂肪酸的分析。对于香气物质的分析鉴定，顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱（headspace solid phase microextration-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技术已被广泛运用，也是目前提取香气物质最有效的方法之一。因此，将NMR和HS-SPME-GC-MS结合使用对奶油主要成分的定量和香气物质的鉴定具有非常理想的效果。

奶油因为其香浓的气味而被广泛喜爱，也常被用于焙烤食品的制作，也因其脂质含量高的特点，普遍认为奶油风味来源仅为甘油三酯。本实验分别利用NMR和GC-MS测定加热前后奶油中的主要成分和挥发性化合物的组成，研究分析其变化机理，以期为奶油风味和产品的研究提供思路；同时根据加热过程中奶油主要成分和香气化合物的联系，进一步讨论奶油组分在其香气化合物形成中的作用，为开发一种风味增强剂提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜牛奶由广西大学奶牛养殖基地提供。

氘代水（DO）、3-(三甲基硅基)丙磺酸钠盐（3-(trimethylsilyl)-1-propane sulfonic acid silane，DSS，0.001 g/100 μL）、氘代氯仿（99.8% CDCl＋0.03%四甲基硅烷） 上海麦克林生化科技有限公司；香气化合物标准品：2-甲基丁醛、壬醛、麦芽酚、()-2-戊醛、己醛、对甲苯酚、辛醛、苯酚、(,)-2,4-癸二烯醛、(,)-2,4-庚二烯醛、()-2-壬烯醛、()-癸烯醛、2-呋喃甲醇、庚醛、糠醛、己酸、2,4-二叔丁基苯酚、2-戊基呋喃、辛酸、辛酸乙酯，2(5)-呋喃酮、5-甲基-2-呋喃醛、2-乙酰基呋喃、2,3-二甲基吡嗪和正构烷烃 上海Sigma-Aldrich贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

高速冷冻离心机 天美（中国）科学仪器有限公司；AVANCE III HD 600 NMR仪 德国Bruker公司；SAAB-57328U 50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头 美国Supelco公司；7890B-5975 GC-MS仪 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

参考Kanno等的方法并稍作调整。取1.00 kg鲜牛奶，水浴加热至38 ℃后，立即在20 ℃、6 380×离心20 min，收集上层奶油，于4 ℃条件下贮存。

取0.50 g新鲜奶油置于容器中，用铝箔纸密封。由于奶油通常用于焙烤食品的制作，如曲奇饼干焙烤温度通常为160～200 ℃，时间为15～30 min。因此将奶油置于160 ℃加热30 min，即为加热奶油样品。每次测量前取2 份相同新鲜奶油，一份作为加热前奶油样品，另一份制备加热奶油样品。每组样品一式3 份，取自同一批鲜牛奶。

1.3.2 NMR分析

称量0.50 g新鲜奶油于2 mL EP管中，分别加入1 mL DO和1 mL CDCl，漩涡至样品溶解，静置分层。取550 μL水层，添加50 μL内标DSS，混合均匀后转移至5 mm核磁管中，同样移取600 μL CDCl层于另一核磁管中，待测。称量0.50 g新鲜奶油于160 ℃加热30 min后，转移至2 mL EP管中，其余操作步骤与新鲜奶油一致。

H-NMR谱测定条件：载波频率500 Hz，检测温度25 ℃，谱宽10 ppm，弛豫时间10 s，获取数据点16 000。为采集DO和CDCl中的H-NMR谱，扫描次数分别为32和64。同时通过预饱和抑制水信号。NMR光谱处理和标峰使用MestReNova（14.1.1）软件完成。在计算各化合物峰值时采用全局光谱去卷积算法对重叠区域进行反卷积，以对在拥挤光谱区域出现共振的化合物进行绝对定量。在H-NMR谱中信号面积与样品中存在的质子数成正比，分别对DO和CDCl的H NMR谱图中单个信号进行积分，并通过与内标信号比较，计算极性和非极性组分含量。奶油中极性组分含量表示为每100 g（干质量）奶油中所含极性组分的质量，单位为%；非极性组分含量表示为每100 moL奶油中所含组分的物质的量，单位为%。

1.3.3 HS-SPME

参考Guo Dong等的方法并稍作调整。样品制备好后转移至顶空瓶，将顶空瓶于50 ℃水中平衡5 min。将已老化好的萃取头插入样品瓶中，用手柄推出石纤维头，将其暴露在瓶内上方，恒温50 ℃萃取60 min，用手柄将纤维头推回针头内，拔出萃取头插入GC-MS进样器中解吸3 min。

1.3.4 GC-MS分析

使用极性D B-WA X 柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），升温条件：柱初温40 ℃，维持2 min，以3 ℃/min上升至225 ℃，维持1 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，维持5 min。进样口温度250 ℃，离子源温度230 ℃，传输线温度280 ℃，四极杆温度150 ℃，电子能量70 eV，载气He，质量扫描范围/30～350。数据存储在化学工作站。通过把质谱图与NIST 14质谱数据库中的化合物图谱进行匹配对化合物进行初步定性，再利用同一条件下正构烷烃的保留时间计算每个化合物的保留指数（retention index，RI），同时和NIST数据库比较对样品进一步定性。本实验旨在比较加热前后奶油样品中同一化合物含量的相对变化，因此未对挥发性化合物进行准确定量，仅利用峰面积表示其含量。

1.4 数据分析

NMR和GC-MS的数据使用SPSS 23.0软件进行独立样本检验，显著水平=0.05。

2 结果与分析

2.1 1H NMR定量分析加热前后奶油非挥发性组分的变化

图1为加热前后奶油中极性组分的H NMR谱图，为便于观察比较，未加热奶油和加热后奶油采用相同比例绘制。由图1和表1可知，在加热前后奶油极性组分存在较大差异。乳糖是奶油中含量最高的极性组分，含量为3.861%，一般鲜奶油中乳糖含量为2.8%～4.0%。加热后乳糖含量减少了74%，因为乳糖经过热处理会分解为半乳糖和葡萄糖，然后与氨基酸发生美拉德反应。而仅在加热后奶油中检测到乳糖的分解产物葡萄糖，含量为0.085%。除碳水化合物，在新鲜奶油中还检测到少量游离氨基酸，加热后天冬氨酸含量减少得最多，加热前天冬氨酸（0.234%）是新鲜奶油中含量最高的氨基酸，加热后含量减少了84%；其次是甲硫氨酸（0.045%），加热后含量减少了80%；亮氨酸（0.154%）、酪氨酸（0.043%）、苯丙氨酸（0.051%）、缬氨酸（0.056%）和异亮氨酸（0.042%）加热后含量分别减少了82%、79%、78%、75%、71%；丙氨酸（0.027%）、精氨酸（0.118%）和赖氨酸（0.118%）的含量加热后分别减少了67%、35%和18%。游离脂肪酸含量也变化显著，尤其是丁酸含量（0.148%）加热后减少了93%；甲酸（0.011%）和乙酸含量（0.004%）在加热后分别减少了75%和43%。在新鲜奶油中还检测到乳酸（0.472%）和琥珀酸（0.003%），这可能来源于乳糖的发酵，加热后乳酸含量减少了64%，而琥珀酸已被消耗完全。这些极性组分在加热前后均表现出显著的含量变化。乳糖和游离氨基酸含量的减少可能与加热过程中美拉德反应的进行密切相关，而有机酸含量的减少则可能是因为加热过程中温度升高使这些化合物挥发，从而含量大幅降低。

图1 加热前后奶油中极性组分的1H NMR谱图Fig.1 1H NMR spectra of polar components in cream before and after heating treatment

表1 加热前后奶油中极性组分含量变化Table 1 Changes in contents of polar components in cream before and after heating treatment

图2为加热前后奶油中非极性组分的H NMR谱图。0.8～0.9处的三重信号由饱和脂肪酸、油酸和亚油酸酰基上甲基质子共同引起；1.2～1.4处的信号由酰基链上多个亚甲基的质子引起；1.5～1.7和2.2～2.3处的信号分别由相对于羧基位于位置和位置的亚甲基质子引起；1.9～2.1是由酰基链上与单个双键相连的位置的亚甲基质子引起；2.03处的信号由脂肪酸酰基链上的烯丙基质子引起；2.7和2.8处的信号分别由亚油酸和亚麻酸酰基链中相对于两个双键位于位的亚甲基质子引起；3.7处的双重信号由1,2-双甘酯在甘油基-3位的亚甲基质子引起；3.85处的双重峰为2-单甘酯-1和-3位置上的质子给出的信号；3.99处的多重峰归属于1-单甘酯-2位的质子；4.1～4.3和5.2分别由甘油三酯中甘油基的-1,3位和-2位的质子引起；5.3～5.4则是由不同酰基链上的烯烃质子引起。

图2 加热前后奶油中非极性组分的1H NMR谱图Fig.2 1H NMR spectra of apolar components in cream before and after heating treatment

通过将特定的信号与4.2处甘油三酯甘油基上-1,3位的氢质子信号联系，对甘油酯中单个脂肪酸进行量化。由表2可知，加热前奶油中饱和脂肪酸在总脂肪酸中的相对含量75.87%，不饱和脂肪酸为24.13%，其中油酸21.63%、亚油酸2.11%、亚麻酸0.39%。文献[26]报道，奶油中的饱和脂肪酸在总脂肪酸中占比可达70%，而不饱和脂肪酸占比30%，其中油酸26%、亚油酸3%、亚麻酸0.6%，与本实验中测得的脂肪酸含量基本一致。经加热处理后，饱和脂肪酸含量减少了18%，不饱和脂肪酸含量减少了23%。不饱和脂肪酸更易发生氧化，因此在相同条件下其含量较饱和脂肪酸减少更多。在不饱和脂肪酸中，亚油酸含量减少最为显著，加热后含量减少了59%；其次是亚麻酸，加热后含量减少了23%；最后是油酸，加热后含量减少了20%。除脂肪酸之外，还在奶油中检测到1,2-双甘酯（0.65%）、1-单甘酯（0.21%）、2-单甘酯（0.05%），这是因为少量甘油三酯发生水解，先水解成1,2-甘油二酯，再水解成1-单甘酯和2-单甘酯，3 种物质加热后含量分别减少了17%、14%、54%。非极性组分中脂肪酸含量的减少可能是因为加热过程中的氧化以及甘油酯水解产生的部分短链脂肪酸形成了奶油中的香气化合物。

表2 加热前后奶油中非极性组分的含量变化Table 2 Changes in contents of apolar components in cream before and after heating treatment

2.2 GC-MS分析加热前后挥发性香气物质的变化

图3对比了加热前后奶油中挥发性化合物总离子色谱图。由表3可知，在未加热奶油中，脂质来源的香气化合物普遍存在，经过加热后这些化合物的含量均有所增长。丁酸、己酸和辛酸含量在加热后分别增加至加热前的4、2 倍和6 倍以上，癸酸含量在加热后增加至46 倍，这可能是因为加热后甘油三酯脂肪酸链的水解使得饱和脂肪酸含量增加。甲基酮和内酯分别来自饱和脂肪酸的-氧化和羟基酸的内酯化，2-戊酮、2-庚酮和2-壬酮含量在加热后分别增加至加热前的36、215 倍和157 倍，-己内酯、-辛内酯、-癸内酯和-十二内酯的含量在加热后分别增加了42、44、48 倍和91 倍。以亚油酸为前体的己醛、()-2-壬烯醛、(,)-2,4-癸二烯醛和1-辛烯-3-酮的含量在加热后分别增加了4、10、28 倍和25 倍，以油酸为前体的壬醛在加热后含量增加了2 倍。

图3 HS-SPME-GC-MS测定加热前后奶油中挥发性化合物的总离子色谱图Fig.3 Total ion current chromatograms of volatile compounds in cream before and after heating treatment

表3 加热前后奶油样品中的关键香气物质Table 3 Key odorants identified in the headspace of cream samples before and after heating treatment

在未加热奶油中检测到少量美拉德反应产物，如2-甲基丁醛和3-甲基丁醛，其含量在加热后分别增加了10 倍和6 倍；糖降解产物糠醛也在未加热奶油中被检测到，其含量在加热后增加了179 倍。当温度达到50 ℃时会发生美拉德反应，而挥发性香气物质的萃取是在50 ℃水浴下进行，这可能是在未加热奶油中发现这些美拉德产物的原因。而其他美拉德反应产物，如甲硫基丙醛、甲基吡嗪、麦芽酚和呋喃酮，均只在加热后奶油中检测到。

2.3 风味前体物质对奶油香气形成的影响

麦芽酚在加热奶油的关键香气物质中含量最高，麦芽酚是二糖的特异性产物，加热过程中少量乳糖在氨基酸影响下被转化为麦芽糖，再经2,3-烯醇化形成麦芽酚。此外，美拉德反应中生成的Amadori产物也可直接形成麦芽酚。乳糖是奶油中含量最高的极性组分（表1），也是奶油中唯一的还原性二糖，因此加热后乳糖的大量减少与麦芽酚的形成密切相关。加热后呋喃类化合物含量的增加也较显著。呋喃形成的5 种主要途径为多不饱和脂肪酸的氧化、碳水化合物的热降解、还原糖与氨基酸的美拉德反应、抗坏血酸及其衍生物的分解，以及类胡萝卜素的氧化。在加热奶油中大部分呋喃类化合物可能主要来源于美拉德反应，丙氨酸、天冬氨酸等氨基酸经热降解产生乙醛，而糖热降解可以生成乙醇酸，乙醛和乙醇酸经过环化和脱水后发生羟醛缩合形成呋喃。天冬氨酸是加热前奶油极性组分中含量最高的氨基酸，也是加热后含量减少最多的氨基酸；此外，在加热后奶油中检测到少量葡萄糖，说明在加热过程中呋喃的形成与乳糖和氨基酸的相互作用有关，这也解释了乳糖和氨基酸含量的大量减少。此外，Strecker醛类含量在加热后均有显著增加，2-甲基丁醛和3-甲基丁醛表现出类似麦芽的香气，甲硫基丙醛则表现出类似烤土豆的香气，这些均为焙烤食品中的特征风味化合物。2-甲基丁醛和3-甲基丁醛由异亮氨酸和亮氨酸的Strecker降解形成。此外，Amadori重排产物经过1,2-或2,3-烯醇化、脱水和水解后转化为-羰基化合物，再与相应的氨基酸发生Strecker反应也可生成Strecker醛类。结合表1和表3分析，2-甲基丁醛和3-甲基丁醛含量的增多也与其前体物质异亮氨酸和亮氨酸含量的减少相对应。甲硫基丙醛仅存在于加热后奶油中，且其含量相较其他关键香气化合物并不高，但甲硫氨酸含量在加热前后变化幅度很大，可能是由于甲硫基丙醛的热不稳定性，其在加热过程易分解成甲硫醇，进一步氧化成二甲基二硫化合物并流失。甲基吡嗪只在加热后奶油中检测到，其生成也是基于美拉德反应和Strecker降解，美拉德反应初期发生Amadori重排，导致包括-二羰基在内的还原酮的形成，然后Strecker降解将-二羰基转化为-氨基羰基，进而缩合形成吡嗪。吡嗪的前体物质非常丰富，如-氨基丁酸、乙偶姻、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、乙酸，这些组分都可为Strecker醛类的生成提供氨基，从而促进这类化合物的形成。由表1可知，奶油极性组分中存在许多可以提供氨基的前体物质，这些物质对美拉德反应产物的形成具有不可忽视的作用，因此奶油极性组分在加热后含量大量减少。

挥发性短链脂肪酸对奶油中的奶酪香气具有积极作用，其中丁酸对奶油香气贡献最大，阈值最低，仅50.5 mg/kg。由表3可知，饱和脂肪酸在未加热奶油中含量很高，而饱和脂肪酸来自甘油三酯中脂肪酸链的水解，这说明在加热前奶油中已有少量甘油三酯发生水解。此外，丁酸和其他短链、中链脂肪酸主要位于乳脂肪的-3位，而由表2可知，1,2-双甘酯和单甘酯均在加热前奶油中检测到，说明甘油三酯-3位脂肪酸链被释放。因此，在未加热奶油的挥发性物质中存在较高含量的短链和中链脂肪酸。经过加热后，饱和脂肪酸含量增加，说明甘油酯水解程度加深，因此，双甘酯和单甘酯含量显著减少。甲基酮对奶酪风味及牛奶味具有重要贡献，2-庚酮和2-壬酮作为主要的特征风味化合物，其在加热后奶油中含量增加显著。甲基酮由饱和脂肪酸经过-氧化生成-酮酸，再经脱羧形成。奶油中含有75.87%的饱和脂肪酸，这为甲基酮的形成提供了充足的前体物质。另外，内酯也是饱和脂肪酸的氧化产物，是由羟基脂肪酸分子内酯化形成的环状化合物，通常具有强烈的、令人愉快的感官特性，尤其是-十二内酯。内酯含量在加热后也显著增加。因此，甲基酮和内酯含量的大幅增加可以解释奶油中饱和脂肪酸含量的减少。在由不饱和脂肪酸氧化而来的关键香气化合物中，1-辛烯-3-酮含量增加最多，是由亚油酸在C13位发生氧化，伴随C10和C11位键断裂，然后经氢交换反应形成。己醛和(,)-2,4-癸二烯醛分别来自于亚油酸在氧化过程中C9和C13位形成的氢过氧化物，()-2-壬烯醛和壬醛分别为亚油酸和油酸的降解产物。有研究指出不饱和醛类加热发生降解，既可被还原成醇，也可能被氧化成酸，而且这些醛类也可进一步参与美拉德反应，如2,4-癸二烯醛与氨基反应产生更多的含氮化合物，这解释了加热过程中醛类含量增加相对较少而不饱和脂肪酸大量减少的原因。

关键香气化合物中饱和脂肪酸降解产物含量的增加幅度明显大于不饱和脂肪酸降解产物，这是因为奶油中饱和脂肪酸含量远高于不饱和脂肪酸，而且多不饱和脂肪酸也会促进脂质脂肪酸的自氧化。对于来源于不饱和脂肪酸的醛类和酮类，在未加热奶油中油酸降解产生的壬醛含量虽低于亚油酸降解产生的醛类，但其在加热后含量增加最多，且在未加热奶油中油酸含量也为最高。这表明奶油中风味前体物质含量越高，经过加热处理后该风味化合物含量增加越显著。

3 结论

利用NMR和SPME-GC-MS对奶油中的主要成分和挥发性化合物进行研究，分析加热过程中两者的变化。结果表明，乳糖和少量的游离氨基酸、游离脂肪酸和有机酸是奶油中主要的极性组分，这些物质在加热后大量减少，以乳糖和游离氨基酸含量减少最多；甘油三酯以及少量的双甘酯和单甘酯为奶油中主要的非极性组分，其在加热后含量减少相对较少。脂质来源的香气化合物普遍存在于未加热奶油中，经加热后，甲基酮和内酯含量大幅增加，而短链脂肪酸和醛类含量的增加相对较少。美拉德反应产物含量增加最显著，而且甲硫基丙醛、麦芽酚和呋喃酮仅在加热后奶油中被检测到。对加热前后奶油中非挥发性和挥发性化合物的变化比较分析发现，加热奶油中美拉德反应产物的形成是奶油中极性组分含量大量减少的原因，脂质来源香气化合物含量的增加与奶油中脂肪酸含量的减少相对应，当奶油中风味前体物质含量越高，加热后该风味化合物含量增加越显著。本研究结果为奶油风味和产品的研究提供了理论基础。