陕北3 个枣品种果实代谢产物及代谢途径分析

贾宇尧，王 超，石倩倩，韩 刚

（西北农林科技大学林学院，陕西 杨凌 712100）

枣（Mill.）为鼠李科（Rhamnaceae）枣属（）植物，是原产于中国的药食兼用型经济树种，枣果富含各类营养及药用成分，在居民饮食及传统医药中发挥着重要作用。陕北黄河流域作为中国枣发源地之一，具有悠久的枣栽培历史，栽培广泛，尤以清涧木枣、佳县油枣和延川狗头枣为主，种植面积达210多万亩，在地方产业发展中具有重要作用。枣富含碳水化合物、氨基酸、维生素、三萜酸及黄酮类等营养成分，不仅被广泛应用于食品加工业，而且还有杀菌抗炎、抗氧化、抗癌、护肝及保护肠道等药理作用，上述有益功效均与其中所富含天然活性成分密切相关。相关研究在玉米、荔枝及核桃上均表明，由于同一物种内不同品种生长发育过程中代谢产物和代谢机制的差异，可能导致其表现出不同的品质和特性。关于枣代谢物质已有诸多研究，但大部分研究均集于特定类别代谢物，如糖、氨基酸、黄酮及脂肪酸等，缺乏对枣果实代谢物的综合性分析，尤其不同枣品种间代谢成分的差异研究鲜有报道。为全面了解枣果实代谢成分，比较陕北主栽枣品种间的代谢物质差异，仍需要从代谢组学角度出发，对其代谢物进行定性及定量分析。

代谢组学是对生物体内分子质量小于1 000 Da的小分子内源性代谢物进行的全面、系统的定性和定量研究。目前，基于超高效液相色谱-串联质谱（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）的代谢组学技术因其优良的色谱分离度、高灵敏度和高分辨率而被广泛用于食品科学、医学和植物学等多个领域，明确不同品种枇杷的主要风味物质，产区间枸杞的营养差异及不同香型绿茶非挥发性成分差异等，逐渐成为探索生物代谢差异的最佳方法之一。

本研究采用UPLC-MS/MS的广泛靶向代谢组学技术对陕北3 种枣果实的代谢物进行分离鉴定，筛选并分析不同枣品种间的差异代谢物及主要代谢通路，揭示陕北主栽枣品种间的代谢差异，以期为枣果实的品质分析、功能研究及分类加工提供理论和参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试材料清涧木枣（QM）、佳县油枣（JY）和延川狗头枣（YG）果实样品均于2018年10月（完熟期），分别采自各原产地管理良好的枣园。每个品种选择5 株生长健康、长势及坐果基本一致的盛果期枣树，每株随机选取20 个完熟期果实，每个品种合计100 个果实，带回实验室。在室内（温度15～25 ℃，相对湿度45%～70%）条件下阴干至含水量23%左右，每个品种果实均分成3 份（即3 次重复），去核后于－80 ℃超低温冷冻保存备用。

甲醇、乙腈、乙醇（均为色谱纯） 德国Merck公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

Scientz-100F冻干机 宁波新芝公司；MM 400研磨仪 德国Retsch公司；5430R台式高速冷冻离心机德国Eppendorf公司。

样本代谢物数据采集仪器系统主要包括Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30AUPLC（日本岛津公司）和Applied Biosystems 6500 Q TRAP串联质谱（美国赛默飞世尔公司）。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

将超低温冷冻保存试样置于冻干机进行真空冷冻干燥，用研磨仪研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末状；准确称取100 mg粉末，溶解于1.0 mL提取液（70%甲醇溶液）中，溶解后置于4 ℃冰箱过夜，期间涡旋3 次（每30 min涡旋1 次，每次持续30 s），提高提取率；10 000×离心10 min后，吸取上清液，微孔滤膜（0.22 μm）过滤，并于进样瓶保存，用于UPLC-MS/MS分析。

1.3.2 UPLC-MS/MS分析

UPLC条件：ACQUITY UPLC HSS T3 C色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 µm）；流动相：A相为超纯水（加入0.04%乙酸），B相为乙腈（加入0.04%乙酸）；洗脱梯度：0.0～11.0 min，95%～5% A、5%～95% B，保持1 min；1 2.0～1 2.1 min，5%～9 5% A、95%～5% B，并平衡至15.0 min；流速0.4 mL/min，柱温40 ℃，进样量2 μL。

MS条件：线性离子阱和三重四极杆扫描是在三重四极杆线性离子阱质谱仪、AB6500 Q TRAP UPLC/MS/MS系统上获得的，该系统配备了ESI Turbo离子喷雾接口，可由Analyst 1.6.3软件（AB Sciex）控制运行正负2 种离子模式。电喷雾离子源（electrospray ionization source，ESI）操作参数如下：离子源，涡轮喷雾；离子源温度550 ℃；离子喷雾电压5 500 V（正离子模式）/－4 500 V（负离子模式）；离子源气体I、气体II和帘气分别设置为50、60 psi和25.0 psi，碰撞诱导电离参数设置为高。在三重四极杆模式下用10 μmol/L聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准。三重四极杆扫描使用质谱多反应监测（multiple reaction monitor，MRM）模式，并将碰撞气体（氮气）设置为中等，通过正交试验确定每个代谢物最优的去簇电压（0～150 V）和碰撞能（0～80 eV），完成各个MRM离子对的扫描检测。根据每个时期内洗脱的代谢物，在每个时期监测一组特定的MRM离子对。

1.4 数据统计与分析

基于武汉迈特维尔生物科技有限公司自建数据库（Metware database）及代谢物信息公共数据库根据二级谱信息进行物质定性；通过MRM扫描，利用物质检测的5 个参数（去簇电压、碰撞能、保留时间、母离子、特征碎片离子），检测不同样本中的物质相对含量，获得物质的定性定量数据。对照定量方式通过获得不同样本的代谢物质谱分析数据后，对所有物质质谱峰进行峰面积积分，并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正，每个色谱峰的峰面积代表对应物质的相对含量。

对3 组红枣样本（QM、JY和YG）代谢物进行两两比较，分别记为QM vs JY、QM vs YG、JY vs YG。通过SMICA 14.1进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）探析3 种枣果间的代谢特征。根据OPLS-DA模型的变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值不小于1.0和差异倍数（fold change，FC）值不小于2.0（上调）或不大于0.5（下调）筛选组间差异代谢物，并用-检验（双尾平均值）评估代谢物含量差异的显著性（＜0.05）。最后，对差异代谢物进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）注释，并结合MBRole2.0（Metabolites Biological Role）和R软件进行相关通路分析。

2 结果与分析

2.1 代谢物分离与鉴定

如表1所示，总共鉴定出462 种代谢物，主要包括脂质、生物碱、黄酮、氨基酸及其衍生物、有机酸、酚酸、核苷酸及其衍生物、糖及醇类、三萜酸和维生素等15 类初次级代谢物质。各类代谢物质的相对含量在3 个枣品种间表现为，QM与JY相接近，但二者均与YG存在较大差异，主要体现在脂质（QM≈JY＞YG）、黄酮（QM＞JY＞YG）、氨基酸及其衍生物（YG＞JY＞QM）、生物碱（YG＞JY＞QM）和有机酸（YG＞QM＞JY）等代谢物。

表1 枣果实代谢物统计Table 1 Statistics of metabolites in different jujube cultivars

2.2 PCA与HCA结果

对3 种枣果实的总代谢物（462 种）进行PCA，结果如图1A所示。PC1为68.0%，PC2为21.2%，累计贡献率达89.2%。其中，各枣品种样本内部聚集程度较好，品种间也表现出明显的分离趋势。图1B显示，JY与QM的代谢物种类与含量较为接近，聚为同一类；而YG单独聚为另一类，与QM、JY差异较大。结合PCA和HCA共同表明，此3 种枣果实具有不同的代谢特征。

图1 枣果实代谢物PCA得分图（A）及HCA（B）Fig.1 PCA score plot (A) and hierachical cluster analysis (B) of metabolites in jujube fruits

2.3 差异代谢物筛选

如图2、表2所示，QM vs JY的36 种差异代谢物（上调11 种，下调25 种）中，主要包括黄酮类（11 种）、酚酸类（5 种）、脂质（4 种）、生物碱（4 种）4 种类别；QM vs YG的193 种差异代谢物（上调80 种，下调113 种）与JY vs YG的204 种差异代谢物（上调95 种，下调109 种）中，主要差异成分均为脂质、生物碱、黄酮、氨基酸及其衍生物、有机酸及酚酸类5 个类别。

图2 枣品种间代谢物火山图Fig.2 Volcano plots of metabolites among jujube cultivars

表2 枣品种间差异代谢物统计Table 2 Statistics of differential metabolites among jujube cultivars

2.4 差异代谢物分析

2.4.1 共有差异代谢物分析

根据图3A可知，QM vs JY、QM vs YG和JY vs YG间存在10 种3 组共有差异代谢物。如图3B所示，酸枣仁碱A、酸枣仁碱D、溶血磷脂酰乙醇胺16:0、表儿茶素-(4,8)-表儿茶素-(4,8)-表儿茶素木犀草苷和原花青素B3的含量在QM中最高，分别为JY、YG的2.13～4.87 倍和2.42～7.66 倍；山矾碱戊糖、-(＋)-蔗糖、氧化型谷胱甘肽及紫丁香苷的含量在YG中最高，分别为QM、JY的3.79～9.00 倍和3.48～19.44 倍；然而，10 种组间共有差异代谢物的含量在JY中均为最低。

图3 枣组间差异代谢物韦恩图（A）和共有差异代谢物热图（B）Fig.3 Venn diagram (A) and heat map (B) of shared differential metabolites between jujube cultivars

2.4.2 特有差异代谢物分析

如图3A所示，特有差异代谢物以JY vs YG最多（37 种），QM vs YG次之（27 种），QM vs JY最少（5 种）。由表3可知，JY vs YG的特有差异代谢物以酚酸类（4 种）、氨基酸及其衍生物（3 种）、黄酮（3 种）、生物碱（3 种）、有机酸（3 种）、脂质（3 种）及萜类（3 种）为主，其中高龙胆酸、′-甲酰基犬尿氨酸、苯甲酸、牛角花素、植烷酸、反式-4-羟基肉桂酸甲酯、美洲茶酸、-天冬酰胺、坡模酮酸、1-甲基组氨酸及十五元环肽生物碱J的含量在YG中显著上调（＜0.05），为JY的2.09～8.51 倍；而扁蓄苷、异牡荆素、没食子酸、龙胆酸、-酮戊二酸、3-氨基异丁酸、-亚麻酸、四羟基黄烷及十八碳-11,13,15-三烯酸的含量在YG中均显著下调（＜0.05），不及JY的1/2。

表3 JY vs YG特有差异代谢物统计Table 3 Statistics of specifci differential metabolites between JY and YG

由表4可知，QM vs YG中特有差异代谢物主要包括7 种脂质、7 种黄酮、3 种酚酸类、2 种氨基酸、2 种核苷酸及其衍生物及2 种有机酸，YG中的氨基酸、酚酸及核苷酸类物质含量均显著上升（＜0.05），如-苏氨酸、-亮氨酸、对羟基苯甲酸、5--对香豆酰莽草酸、对香豆酸、2’-脱氧鸟苷、5-甲基尿苷，为QM的2.03～3.20 倍；而脂质（溶血磷脂酰胆碱2:0/15:2/15:0 (-2)/17:0/15:1 (-1)/19:1）、黄酮（异鼠李素--芸香苷、异槲皮苷、表儿茶素、槲皮素-3--洋槐糖苷、桑色素、没食子儿茶素）及有机酸（2,3-二甲基丁氨酸、草酰乙酸）的含量显著下降（＜0.05），且仅为QM的1/4～1/2。

表4 QM vs YG特有差异代谢物统计Table 4 Statistics of specific differential metabolites between QM and YG

如表5所示，QM vs JY仅存在5 种特有差异代谢物，包括2 种有机酸、1 种酚酸类、1 种黄酮及1 种脂质。其中上调代谢物2 种：棕榈醛（FC=4.53）、甲基戊二酸（JY、YG特有）；下调代谢物3 种：对氨基苯甲酸（FC=0.26）、对羟基苯甲酸（FC=0.44）、表儿茶素--表儿茶素--表儿茶素（QM、YG特有）。

表5 QM vs JY特有差异代谢物统计Table 5 Statistics of specifci differential metabolites between QM and JY

2.4.3 差异代谢物通路分析

如图4所示，点的颜色为值（越红表示富集越显著），点的大小为所富集的差异代谢物个数（越大表示个数越多）。QM vs JY中的差异代谢物共分布于27 条代谢通路，显著差异代谢通路4 条（＜0.05）（图4A），主要为苯丙烷类生物合成途径与谷胱甘肽代谢途径。JY相比于QM，苯丙烷类生物合成途径共4 种差异代谢物参与，包括咖啡酸（FC=2.34）、3,4-二羟基苯甲酸（FC=2.15）、儿茶素（FC=0.44）、对氨基苯甲酸（FC=0.26）。而谷胱甘肽代谢途径只有腐胺和氧化谷胱甘肽2 种差异代谢物参与，且含量均于JY中显著降低（FC＜0.3）。

QM vs YG中的差异代谢物共参与106 条代谢途径，显著差异通路18 条（＜0.05）（图4B），主要包括氨基酸代谢（氨酰tRNA生物合成，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，色氨酸、苯丙氨酸代谢）、苯丙烷类生物合成及类黄酮生物合成途径。氨基酸代谢共18 种差异代谢物参与，其中-色氨酸、-苯丙氨酸、-酪氨酸、-亮氨酸、-组氨酸、对羟基苯甲酸、-缬氨酸、-苏氨酸、2-氧代己二酸、-异亮氨酸、吲哚、对香豆酸、紫丁香苷、2-异丙基苹果酸、2-(甲酰氨基)苯甲酸和甲氧基吲哚乙酸的含量在YG中更高，为QM的2.03～6.72 倍；仅-谷氨酸与犬尿喹啉酸的含量在YG中较低，不超过QM的50%。使YG的氨基酸代谢较QM更加活跃，氨基酸类物质积累更多。苯丙烷类生物合成共14 种差异代谢物参与（6 种酚酸类、4 种黄酮、3 种氨基酸及其衍生物和1 种有机酸）。其中，芥子酸、咖啡酸、对香豆酸及紫丁香苷等酚酸类物质在YG中代谢更加旺盛，合成量更多，为QM的2.17～6.72 倍。类黄酮生物合成共8 种差异代谢成分参与，包括绿原酸、香橙素、柚皮素查耳酮、儿茶素、紫铆素、表儿茶素、短叶松素和没食子儿茶素，在QM中合成更加旺盛，积累量更多，为YG的2.26～5.29 倍。

JY vs YG中的差异代谢物共参与110 条代谢途径，显著差异通路16 条（＜0.05）（图4C），主要为类黄酮生物合成、苯丙烷类生物合成及氨基酸代谢（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，氨酰tRNA生物合成，色氨酸代谢，组氨酸代谢，苯丙氨酸代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成）途径。其中，类黄酮生物合成途径共5 种差异成分参与（4 种黄酮和1 种酚酸），且JY中的香橙素、柚皮素查耳酮、紫铆素和短叶松素等黄酮类物质合成更旺盛，积累量更多，为YG的3.13～4.35 倍。苯丙烷类生物合成途径共11 种差异代谢物参与（6 种酚酸、3 种氨基酸和2 种黄酮），其中芥子酸、紫丁香苷、对香豆酸、-酪氨酸、-苯丙氨酸和-色氨酸在YG中代谢更活跃，含量更高，为JY的2.06～5.75 倍；绿原酸、二氢山柰酚、柚皮素查耳酮、没食子酸及原儿茶酸的代谢则在JY中更旺盛，积累量较多，为YG的3.26～4.35 倍。相比于JY，YG中的氨基酸代谢更加活跃，共20 种差异代谢成分（10 种氨基酸及其衍生物、4 种酚酸类、3 种有机酸及3 种生物碱）参与，其中’-甲酰基犬尿氨酸、-异亮氨酸、-天冬酰胺、-酪氨酸、-缬氨酸、-苯丙氨酸、-色氨酸、-组氨酸、1-甲基组氨酸在YG中积累量更多，为JY的2.12～7.36 倍。

图4 差异代谢物KEGG富集图Fig.4 KEGG enrichment maps of differential metabolites

3 讨论

有关枣果实代谢物研究已有诸多报道，Feng Zhihong等基于UPLC-MS/MS的广靶技术在不同成熟期的壶瓶枣中共检测到406 种代谢成分；Wang Lina等通过高效液相色谱-紫外检测法在15 种枣果中主要检测出6 种还原糖和8 种有机酸；Guo Sheng等采用UPLC-MS/MS和高效液相色谱-蒸发光散射检测法在6 个发育时期的灵武长枣中共鉴定出10 种三萜酸、14 种核苷类及3 种糖类。然而，本研究采用UPLC-MS/MS的广泛靶向代谢组学技术在陕北3 个枣品种果实中共检测到15 类462 种代谢物，主要包括84 种脂质、55 种生物碱、54 种黄酮、49 种氨基酸及其衍生物、45 种有机酸、41 种酚酸类、31 种核苷酸及其衍生物、19 种三萜酸、17 种糖及醇类、12 种维生素等其他初次级代谢物，较前人所报道的代谢物数量更多。

殷晓等在陕北枣品种群遗传结构的SSR分析中表明，QM、JY同属于木枣品种群，二者亲缘关系较近，而YG属于狗头枣品种群，与QM、JY亲缘关系较远；李晓鹏等关于枣叶脉序研究也发现，QM与JY的叶脉序特征相似，均与YG存在较大差异。本实验也发现陕北3 个枣品种间的差异代谢物数量呈现出JY vs YG（204 种）＞QM vs YG（193 种）＞QM vs JY（36 种）的趋势，表明JY与QM的差异较小，YG与QM、JY的差异较大。因此，本研究于代谢层面所发现的QM、JY、YG间的差异关系与前人从分子水平和生理特征分析上所得结论一致。

QM与JY的代谢成分差异较小，仅部分黄酮类物质含量在QM中较高，尤以原花青素为主。原花青素是以黄烷-3-醇为结构单元通过C—C键聚合而成的化合物，根据其聚合程度可分为单倍体、寡聚体和多聚体，其中最简单的原花青素为儿茶素和表儿茶素，为目前发现的最好的天然抗氧化剂之一，更具有抗癌、抗肿瘤、降血糖及降血脂等多种药用价值。

YG与QM、JY的代谢差异较大，差异物质多以脂质、生物碱、黄酮、氨基酸及其衍生物、有机酸及酚酸类物质为主。其中，绝大多数氨基酸及其衍生物、生物碱和酚酸的含量在YG中较高；而脂质、黄酮和有机酸含量则在QM和JY中更高。差异代谢物KEGG通路富集分析也证实，YG的氨基酸代谢与苯丙素类生物合成更旺盛，使其积累了更多的色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）、组氨酸（His）、缬氨酸（Val）、苏氨酸（Thr）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、芥子酸、对香豆酸、咖啡酸及紫丁香苷等氨基酸及酚酸类物质，进而赋予了YG更丰富的营养；而QM与JY中的类黄酮生物合成更活跃，对黄芪苷、芦丁、香橙素、木犀草苷、柚皮素查耳酮、紫铆素、短叶松素、杨梅苷及三叶豆苷等黄酮类物质的积累更多，可提供更强的生物学活性和药理功效，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、治疗心血管疾病、防治糖尿病等。氨基酸类物质作为影响果实营养品质的主要因素之一，与果实的营养及风味形成密切相关。相关研究已在骏枣、壶瓶枣及冬枣中鉴定出17～26 种氨基酸，然而，本研究共鉴定出49 种氨基酸及其衍生物，18 种（上调14 种，下调4 种）在YG中表现显著差异积累。其中，Phe、Trp、Val、His、Thr、Ile和Leu不仅是人体必需氨基酸，为人类提供必要营养，维持机体正常功能，而且作为果实甜味氨基酸（His、Val、Thr）、鲜味氨基酸（Glu、Asp）、芳香氨基酸（Phe、Tyr）及苦味氨基酸（Leu、Ile）等风味氨基酸，赋予了YG独特的风味；Phe、Tyr还是苯丙烷类和黄酮类物质合成的主要前体，如丁香苷、苯丙酸、花青素及原花青素等，在植物的生长发育和防御功能中发挥着重要作用。YG相比于QM、JY在生物碱类物质上也存在一定差异，约78.57%差异生物碱于YG中含量较高。生物碱是一类碱性含氮化合物，主要源自于植物界，包括环肽类和异喹啉类2 种，具有抗菌、护肝、镇痛、降血压、抗癌等多种功效，目前已从枣属植物中分离并鉴定的生物碱类物质约100 种，具有长远的开发利用价值。枣果酸甜口味主要由有机酸和可溶性糖共同影响，本研究共鉴定出45 种有机酸，约18 种表现显著差异积累，其中69%～72%有机酸在YG中含量较低，降低了YG的酸味；同时-(＋)-蔗糖（即蔗糖）作为影响枣果甜味的主要糖类物质之一，在YG中的含量最高，为QM的3.79 倍和JY的11.55 倍，提高了YG的甜味，使得YG较QM、JY的酸甜口感更佳。

综上所述，本研究从代谢层面发现清涧木枣与佳县油枣具有更近的亲缘关系，而与延川狗头枣关系更远；清涧木枣与佳县油枣的类黄酮生物合成更旺盛，黄酮类物质积累更多，药用价值更高，而延川狗头枣的氨基酸代谢及苯丙素类生物合成更活跃，氨基酸及酚酸类物质合成量更多，营养及风味更突出。