白啤中二肽基肽酶-IV抑制肽的虚拟筛选及活性分析

田文慧，孙丽平，张 翠，胡淑敏，庄永亮,，尹 花,

（1.啤酒生物发酵工程国家重点实验室，山东 青岛 266021；2.昆明理工大学食品科学与工程学院，云南 昆明 650500）

二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV）是一种细胞表面的丝氨酸蛋白酶，其主要作用是优先将氨基末端第2个氨基酸为丙氨酸（Ala）或脯氨酸（Pro）的寡肽的氨基末端前2 个氨基酸残基剪切去除。DPP-IV可分解肠道细胞分泌的胰高血糖素样肽-1（glucagonlike peptide-1，GLP-1），而GLP-1可以通过刺激胰岛素、抑制升糖素以及让胰岛素细胞重生等方式降低血糖。因此，DPP-IV抑制剂可以使DPP-IV失活，从而提高GLP-1，预防糖尿病的发生。研究表明，生物活性肽具有生理活性好、功能广泛、安全性高等特点，目前，寻找DPP-IV抑制活性肽逐渐成为热点研究。

常规的生物活性肽筛选方法主要是通过超滤、阴阳离子层析、凝胶柱层析及高效液相色谱等分离手段，结合体内外活性评价进行肽段的确定。随着科学技术的发展，结合计算机辅助设计，通过在线数据及虚拟筛选手段研究肽的活性，可以减少工作强度、降低人工成本和缩短研发周期，同时提高活性肽的鉴定成功率。Zhao Wenzhu等通过虚拟筛选，在线预测了多肽的潜在活性、溶解性、吸收、代谢、毒性等，从鸡蛋蛋白中鉴定出3 条新的血管紧张素转换酶和DPP-IV抑制肽ADF、MIR和FGR。

目前，生物活性肽的来源比较广泛，有乳制品、谷类、蛋、鱼、肉、藻类等。在酿造酒中，活性肽的研究主要集中在红酒、黄酒和白酒，对啤酒中肽的研究较少。啤酒是经典的发酵食品，酿酒原料中的蛋白质可被降解为肽并转移至啤酒终产品中。同时，发酵过程中微生物的胞外分泌、发酵结束后微生物细胞的自溶等也可能向啤酒终产品中引入肽类。白啤是经典啤酒的一种，白啤酒中的“白”指的是酒体未经过滤、不澄清、呈白色。因大麦芽和小麦芽比例、酿造工艺和酵母菌株不同，白啤酒具有独特的风格，营养丰富，口感愉悦，因此，本实验以白啤为研究对象，采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱及软件鉴定其肽段，对潜在生物活性肽进行筛选，并对其进行吸收、代谢、毒性及分子对接进行预测，定向解析出具有潜在DPP-IV抑制活性的肽段。以期为啤酒产业的综合性发展提供理论支持和数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青岛白啤，产品批号0532342949，500 mL，乙醇体积分数4.1%，以下简称白啤；合成的肽段（纯度98%）由南京杰肽生物科技有限公司提供；DPP-IV活性检测试剂盒 美国开曼（密歇根州安娜堡）化学公司；乙酸乙酯（分析纯） 天津市风船化学试剂科技有限公司；乙腈、甲酸（均为质谱级） 德国Merck公司。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

白啤样品过滤除气，量取300 mL，在50 ℃条件下浓缩至50 mL，浓缩液用乙酸乙酯等体积萃取3 次，将萃取后的水样用于肽段分析。

1.3.2 肽段分析条件

色谱条件：色谱柱：Infinitylab Poroshell 120 EC-C（2.1 mm×100 mm，1.9 μm），柱温30 ℃；流动相：A为乙腈（0.1 %甲酸），B为超纯水（0.1 %甲酸）；进样量2 μL；流速0.2 mL/min；梯度洗脱：0～1 min，5% A、95% B；1～2.5 min，5%～10% A、95%～90% B；2.5～12.5 min，10%～25% A、90%～75% B；12.5～20 min，25%～52.5% A、75%～47.5% B；20～22 mi n，52.5%～95% A、47.5%～5% B；22～24 min，95%～5% A、5%～95% B；24～30 min，5% A、95% B。

质谱条件：采用电喷雾正离子源，喷雾电压3.2 kV，数据采集范围/200～2 000，质谱数据扫描模式为Full MS-dd MS，一级和二级质谱的分辨率分别为35 000和17 500。

肽段的分子质量及氨基酸序列利用和Peaks 7.5软件进行解析，筛选出置信度（average local confidence，ALC）大于85%的肽段。

1.3.3 白啤活性肽的初选

1.3.3.1 生物活性预测

使用Peptide Ranker程序（http://bioware.ucd.ie/-compass/biowareweb/Serverpages/Peptide-ranker.php）对已鉴定肽段进行生物活性可能性分析，选择生物活性评分≥0.5的肽段作为潜在的生物活性肽。应用BIOPEP程序（http://www.uwm.edu.pl/Biochemia/biopep/start_biopep.php）中的“profiles of potential biological activity”功能进行数据库搜索，定义活性肽的潜在生物活性及可能存在的活性位点氨基酸序列。

1.3.3.2 活性肽的性质分析

通过PepSMI（https://www.novoprolabs.com/tools/convert-peptide-to-smiles-string）将肽段氨基酸序列转化为简化分子线性输入规范（simplified molecular input line entry system，SMILES）格式，使用admetSAR（http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar1/predict/）预测肽段的吸收、代谢和毒性等性质。本研究主要评价指标为血脑屏障透过（blood-brain barrier penetration，BBB）、人体肠道吸收（human intestinal absorption，HIA）、细胞色素（cytochrome P450，CYP450）综合抑制率和急性口服毒性。

1.3.4 分子对接

1.3.4.1 肽段结构准备

选取Peptide Ranker评价≥0.5且性质分析良好的肽段进行分子对接。利用SYBYL-X 2.1.1软件中Build Protein功能构建肽段的结构，并对其进行优化，设置参数Max Iterations 5 000和Gradient 0.005，确保肽结构的能量最小化。

1.3.4.2 DPP-IV结构准备

DPP-IV（PDB ID:5J3J）的晶体结构从蛋白质数据库中下载（http://www.rcsb.org/pdb）。利用SYBYL-X 2.1.1软件中Surflex-Dock对DPP-IV进行结构处理，把原受-配复合物晶体结构中的配体分子从受体的口袋中分离，除去水分子和其他小分子，加氢、加电荷。根据已有文献报道，选择DPP-IV活性位点的6 个氨基酸残基Arg125、Glu205、Arg358、Tyr547、Ser630、Tyr662生成口袋。

1.3.4.3 分子对接方法及评价

应用SYBYL中的Surflex-dock模块对肽段与DPP-IV进行柔性对接。根据分子对接的步骤设定相关参数，采用了一致性打分函数Concensus Score（C-Score）评价对接结果一致性，C-Score＞4.0表示对接成立；以总得分Total-Score（T-Score）、氢键个数和氢键距离为评判标准，T-Score越高，氢键个数越多，键长越短表明结合能力越强。基于评判标准筛选出最佳结合构象，对获得的最佳结合构象进行进一步探讨，分析和预测肽段与DPP-IV的相互作用情况。

1.3.5 体外DPP-IV抑制活性验证

采用试剂盒（荧光法）对DPP-IV抑制率进行测定。样品孔依次加入10 μL DPP-IV、10 μL样品溶液、30 μL缓冲液，对照孔加入10 μL DPP-IV、40 μL缓冲液，空白孔加入50 μL缓冲液，最后加入50 μL底物启动反应。37 ℃检测荧光值（激发波长360 nm，发射波长465 nm），记录30 min内的结果，按下式计算DPP-IV抑制率：

式中：为对照孔荧光值减去空白孔荧光值的荧光曲线斜率；为样品孔荧光值减去空白孔荧光值的荧光曲线斜率；为稀释倍数。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 白啤主要的肽段分析及活性评价

啤酒在酿造发酵过程中产生了多种化学变化，肽段形成比较复杂，基于蛋白质库的搜索方法可能会忽略一些新肽链的形成，因此，采用Peaks软件中从头测序方法，直接利用质谱数据进行肽链的鉴定，结果如表1所示。白啤中共筛选出68 条ALC≥85%的肽段。肽段的长度为4～14 个氨基酸，分子质量在400～1 700 Da之间，符合生物活性肽的结构特点。先前研究认为，啤酒中的肽类物质主要来源于谷蛋白，谷蛋白是一类储存蛋白质，含有大量的谷氨酰胺（Gln）、谷氨酸（Glu）和Pro。在白啤鉴定出的肽段中，有25 条含有Gln、27 条含有Glu、22 条含有Pro。此外，白啤中一些肽段具有连续的Gln、Glu或Pro序列，如LAVMQQQQQQ、LPQQQAQFK、PPVPHDTD、EELR、TLLSNEEK等。这些肽链的结构特点符合来源于谷蛋白的特征。另外，利用BIOPEP分析鉴定出的肽段，68 条肽段均未有相应报道。

表1 白啤中鉴定的肽段及其生物活性预测评分Table 1 Peptide Ranker scores of major peptides identifeid in white beer

续表1

2.2 抑制DPP-IV活性肽的筛选

2.2.1 Peptide Ranker筛选

Peptide Ranker是通过内置到1神经网络对肽段进行评分，该算法基于不同生物活性肽功能类别共有的一般特征预测肽段的生物活性，能够对新型生物活性肽进行有效筛选。本研究设置活性评价阈值为0.5，筛选得到4 条肽段（表2），分别是SSLW、VPFPHTP、PMAPLPRGSP、LLLP。运用BIOPEP中“profiles of potential biological activity”功能预测4 条肽段的潜在生物活性及活性位点氨基酸序列，结果见表2。通过BIOPEP的生物活性预测可以看出，筛选的4 条肽段存在潜在的DPP-IV抑制活性。

表2 肽段DPP-IV抑制活性预测及活性位点氨基酸序列分析Table 2 Amino acid sequence analysis of active sites in DPP-IV inhibitory peptides

2.2.2 氨基酸活性位点筛选

DPP-IV是一种多功能的蛋白水解酶，首先选择结构上在N端2位具有Pro或Ala残基的底物，从此类肽段的N末端切割二肽（Xaa-Pro-或Xaa-Ala-），将其转化为无活性甚至拮抗的形式。因此，报道的DPP-IV抑制肽大多数结构中具有Pro和Ala，尤其是N端的第2个氨基酸为Pro或Ala，这类结构的多肽具有较强的DPP-IV抑制活性。根据文献对于已有DPP-IV抑制肽结构特征的报道，Peptide Ranker评分较低的肽段中仍有一些符合DPP-IV抑制肽结构规律的肽段。因此，本研究根据氨基酸活性位点对白啤鉴定出的多肽进行筛选，DPP-IV抑制可能性较高的肽段有13 条，如表3所示。

表3 白啤DPP-IV抑制可能性较高肽段Table 3 Possible DPP-IV inhibitory peptides in white beer

2.3 肽段的性质分析

采用admetSAR数据库对筛选肽段的吸收、代谢、毒性进行预测，如表4所示。血脑屏障是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞组成的血浆与脑细胞之间的屏障和脉络丛组成的血浆和脑脊液之间的屏障，与体内其他膜屏障相比，血脑屏障通过形成通透屏障而严格地限制化合物的渗透，许多化合物和靶向药物由于无法在脑组织中达到足够的浓度而不能产生期望的治疗作用。预测结果显示，白啤筛选出的肽段中13 条能通过血脑屏障。口服小分子活性肽主要通过胃肠吸收，活性肽的HIA性质有助于预测其通过小肠的吸收概率，文献表明人体小肠吸收率小于等于30%时，HIA数值为负值，反之为正值。结果表明，筛选的17 条肽段中有6 条在人体小肠可被吸收。代谢预测指标选择CYP450综合抑制率，CYP450是一个能够催化氧化底物中反应惰性化学键的单加氧酶家族，主要存在于肝脏微粒体中，同时也少量分布于小肠、肺、肾、脑中，其主要生物学功能是参与内源物质的生物合成和代谢及外源物质的生物氧化和降解，是代谢过程中的关键酶。预测结果显示，17 条肽段的CYP450综合抑制率均为负数，表明肽段能提高CYP450酶系的活性，加快肽段在体内的代谢速度。毒性预测指标选择急性口服毒性，结果表明，17 条肽段的急性口服毒性均为三级毒性（LD为500～5 000 mg/kg），毒性较低。因此，综合肽段的性质分析，筛选出SSLW、VPFPHTP、LAKLQR、HAQQQVPVEVMR、FPQQRAELA、PPVPHDTD 6 条肽段进行下一步分析。

表4 白啤中肽段的性质分析Table 4 Absorption,metabolism and toxicity characteristics of peptides from white beer

2.4 分子对接

分子对接是研究分子间相互作用，并预测其结合模式和结合力的常用方法。为了进一步筛选具有较高抑制DPP-IV活性的肽段，采用分子对接软件SYBYL-X 2.1.1进行对接模拟，评价筛选的6 条肽段与DPP-IV的结合能力（表5）。结果表明，筛选的6 条肽段中有4 条与DPPIV结合能力较好，肽段HAQQQVPVEVMR和PPVPHDTD的T-Score小于6，表明其与DPP-IV的结合能力较弱。其中VPFPHTP与LAKLQR的T-Score较高，因此，选择该2 条肽段进行进一步分析。

表5 白啤中肽段的分子对接得分Table 5 Molecular docking scores of peptides from white beer

2.5 分子对接构象分析

分子对接构象分析是直观确认肽段抑制酶活机理的主要方法之一。图1～3分别为VPFPHTP、LAKLQR的二级质谱图以及其与DPP-IV对接的最佳构象图。图2A和图3A中红色代表正电荷，紫色代表负电荷，肽段被活性口袋紧紧包裹在蛋白质内部，表明两者结合稳定。

图1 筛选肽段的二级质谱图Fig.1 Secondary mass spectra of selected peptides

图2 VPFPHTP与DPP-IV（PDB:5J3J）结合的最佳构象Fig.2 Optimal conformation for the interaction of VPFPHTP with DPP-IV (PDBI:5J3J)

图3 LAKLQR与DPP-IV（PDBI:5J3J）结合的最佳构象Fig.3 Optimal conformation for the interaction of LAKLQR with DPP-IV (PDB:5J3J)

如表6所示，与DPP-IV的结合中，VPFPHTP可与Asn710、Tyr256、Asp663、Arg669、Tyr631、Gly632、Val546形成9 条氢键，存在12 种疏水作用；LAKLQR与Tyr631、Trp659、His740、Asn710、Asp709形成7 条氢键，存在13 种疏水作用。从氢键的数量和键长以及疏水作用的结果可以看出，两条肽段与DPP-IV相互作用明显，可有效抑制两种酶的活性。

表6 活性肽与蛋白酶作用方式Table 6 Action modes of active peptides and protease

2.6 活性验证

对筛选出的2 条肽段VPFPHTP和LAKLQR进行体外抑制DPP-IV活性评价。VPFPHTP和LAKLQR对DPP-IV有明显抑制活性，其IC值分别为（63.68±3.03）µmol/L和（686.91±12.01）µmol/L，该结果证实本研究建立的筛选生物活性肽的方法较为可靠。肽段VPFPHTP的抑制能力较好，活性强于已报道的肽段IPIPATKT和TKLPVAF，稍弱于LPVPQ和ELHQEEPL。从筛选过程看，VPFPHTP来源于Peptide Ranker筛选，LAKLQR来源氨基酸活性位点筛选，因此在活性肽的初选过程中需要两种方法的结合。不过，从分子对接中发现，VPFPHTP的T-Score低于LAKLQR，因此，在分子对接的分析过程中还需要考虑更多影响因素，方法需进一步完善。

3 结论

建立一种从白啤中快速筛选生物活性肽的方法。利用本方法自白啤中鉴定得到68 条肽段，使用Peptide Ranker程序筛选出4 条具有潜在生物活性的肽段，又通过文献报道的氨基酸活性位点筛选出13 条肽段。通过肽段性质和分子对接评价最终筛选出2 条具有潜在的高DPP-IV抑制作用的肽段，利用分子对接模型理论探析了2 条肽段对DPP-IV抑制作用机理，并对筛选的肽段进行体外活性验证。本实验研究了啤酒中存在的生物活性肽，并解析了其活性作用机理，为啤酒产品的营养成分研发以及精深加工提供了理论支持。