1,4-萘醌衍生物的合成及抗肿瘤活性研究*

2022-06-01马燕燕董常娥武文龙司鑫鑫史大华

江苏海洋大学学报(自然科学版) 2022年1期

秦天，马燕燕，董常娥，武文龙，司鑫鑫，史大华

(江苏海洋大学药学院，江苏连云港 222005)

癌症目前的致死率仅次于心血管疾病[1]。研究表明，多靶点配体可同时调控不同靶点用于癌症治疗，比单靶点药物具有更大的治疗优势[2-3]。许多多靶点药物已经被设计和合成用于治疗癌症[4-5]。Topo Ⅱα是DNA双链裂解[6]过程中的关键酶，在不同的癌细胞中过量表达。已有研究表明，抑制Topo Ⅱα可以致使双链DNA断裂或ATP水解阻断，最终使细胞生长停滞在G1，S和G2期或者直接诱导凋亡[7]。一些1,4-萘醌衍生物被报道具有Topo Ⅱα抑制活性，如散沫花的活性染料成分散沫花素，已被鉴定为有效的抗癌化合物，具有Topo Ⅱα抑制活性[8-10](见图1)。p21蛋白是一种重要的细胞周期调控蛋白，它参与细胞的生长、分化、衰老及死亡过程，同时又与肿瘤发生密切相关，在细胞的生理、病理过程中发挥着重要的作用[11]。p21蛋白能够与cyclin D/cdk形成复合物[12]，还可以通过C端与PCNA相互作用，阻断PCNA活化DNA聚合酶的活性从而抑制DNA的合成，使肿瘤细胞周期停滞在G1期[13]。苯乙酸是一种苯丙氨酸的脱氨基产物,能抑制p21蛋白异戊二烯化,从而对肿瘤细胞有较强的增殖抑制和诱导分化作用[14]。

图1 1,4-萘醌衍生物的设计

为了找到治疗癌症的新型1,4-萘醌衍生物，本文将1,4-萘醌(散沫花素的药效基因)与苯乙酸经缩合反应合成两个1,4-萘醌苯乙酸衍生物，合成化合物对人乳腺癌细胞MCF-7和人肝癌细胞Bel-7402的抗增殖活性采用CCK-8法[15]进行检测。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Tensor 27型红外光谱仪，瑞士Bruker公司；AVANCE Ⅲ-400型核磁共振仪，瑞士Bruker公司；Synapt G2型UPLC-TOF-MS质谱仪，美国Waters公司；柱层析硅胶(300～400目)购自青岛海洋化工有限公司；薄层色谱采用硅胶GF-254预涂板，购自烟台化学工业所。所有试剂均为市售，除非另有说明，否则使用时未作进一步纯化。

1.2 化合物设计

如图2所示，所设计化合物分为3部分，分别是1,4-萘醌基团(A环)、连接基团和苯乙酸部分(B环)。根据此前的分子对接研究结果，1,4-萘醌基团的羰基在与Topo Ⅱα的相互作用中起关键作用，形成多个氢键从而增大对Topo Ⅱα的选择性。本研究利用酰胺键作为连接基团，原因是酰胺分子体积较小，可能利于插入Topo Ⅱα活性结合中段的狭窄区域。此外，酰胺键存在很多氢键受体，更易与相应靶向蛋白形成氢键，使之与结合口袋的结合能力增强，因此选用酰胺作为连接基团，以确保连接基团活性最优。本研究在B环苯乙酸上引入不同体积的取代基以考察空间位阻因素对活性的影响。

图2 1,4-萘醌衍生物的结构

1.3 化合物合成

本文合成化合物的初始原料为1,4-萘醌(1)，如图3所示，将原料1和对苯二胺溶于无水乙醇，在室温下反应8 h得到中间体化合物2[16]。然后，将两个含有不同取代基的苯乙酸与缩合剂HATU、缚酸剂DIPEA溶入二氯甲烷中，冰浴搅拌2 h活化后再投入中间体化合物2，反应12 h后得终产物3a和3b[17]。目标化合物结构如图4所示，均经1H NMR,13C NMR和HRMS确证。

图3 目标化合物的合成路线

图4 化合物3a和3b的化学结构

N-(4-((1,4-二氧基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)-2-(4-硝基苯基)乙酰胺(3a)，深红色固体,熔点279～281 ℃，收率75%。1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)，δ：10.40(s，1H)，9.21(s，1H)，8.26～8.20(m，2H)，8.07(d，J=7.7 Hz，1H)，7.96(d，J=7.6 Hz，1H)，7.89～7.85(m，1H)，7.79(td，J=7.6，1.4 Hz，1H)，7.69～7.61(m，4H)，7.37～7.31(m，2H)，6.05(s，1H),3.86(s，2H)。13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)，δ：182.9，182.1，166.5，149.9，146.6，139.0，136.2，136.1，135.6，135.3，133.3，133.1，132.9，130.8，130.1，126.5，125.7，121.1，119.5，111.8，111.7，109.0，102.5，55.3。HRMS(ESI)，C24H17N3O5,m/z(实测值(计算值)):428.124 5(428.124 6)[M+H]+。

2-(2，4-二氯苯基)-N-(4-((1，4-二氧基-1，4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)乙酰胺(3b)，深红色固体，熔点247～249 ℃，收率68%。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)，δ：10.36(s，1H)，9.22(s，1H)，8.07(dd，J=7.6，1.4 Hz，1H)，7.96(dd，J=7.7，1.3 Hz，1H)，7.87(td，J=7.5，1.4 Hz，1H)，7.79(td，J=7.5，1.4 Hz，1H)，7.68～7.65(m，2H)，7.63(d，J=2.1 Hz，1H)，7.48(d，J=8.3 Hz，1H)，7.43(dd，J=8.3，2.2 Hz，1H)，7.36～7.32(m，2H)，6.05(s，1H)，3.87(s，2H)。13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)，δ：182.9，182.8，167.9，146.7，136.9，135.3，135.6，133.9，133.6，133.6，133.2，132.9，132.7，130.9，128.9，127.7，126.5，126.4，125.8，125.7，124.8，120.3，114.6，102.1。HRMS(ESI)，C24H16Cl2N2O3，m/z(实测值(计算值)):451.061 2(451.061 6)[M+H]+。

1.4 化合物抗肿瘤活性研究

1,4-萘醌苯乙酸衍生物对体外细胞毒活性通过CCK-8法对Bel-7402细胞进行测定。细胞接种于96孔板中，密度为5×103个/孔，CO2(体积分数5%)培养箱中37 ℃培养24 h，更换为DMSO和所需浓度的化合物孵育48 h。然后在每个孔中加入10 μL CCK-8溶液在37 ℃，5%CO2孵箱中孵育2 h。最后，使用酶标仪测量450 nm处的吸光度，计算细胞存活率。

2 结果和讨论

2.1 目标物的合成

关于实验反应条件，由中间体化合物2合成化合物3a，3b，使用二异丙基乙胺(DIPEA)作为缚酸剂，既能够提供碱性反应环境，相较于三乙胺还可以减少同分异构体的生成。由于二氯甲烷对苯乙酸的溶解性较好，故将其确定为溶剂。初始反应时间分别为8，12和24 h，同时利用TLC监测反应物浓度。结果发现反应在12 h后已较为完全，最终确定反应时间为12 h。在酰胺缩合剂的选择上，多次实验发现缩合剂N,N′-羰基二咪唑(CDI)会在反应完成后产生咪唑类杂质，反应缩合剂二环己基碳二亚胺(DCC)会产生无荧光杂质二环己基脲(DCU)，上述两种缩合剂的杂质均不易除去。EDCI虽反应较快，但反应杂质过多，不利于终产物的分离。最终确定HATU为缩合剂，其反应后处理简单，反应活性较强，产物易分离。

2.2 抗肿瘤活性评价

用CCK-8法评价目标化合物3a，3b，对人乳腺癌细胞MCF-7和人肝癌细胞Bel-7402进行抑制活性研究，所得数据见表1。

表1 目标化合物对MCF-7和Bel-7402的抑制活性

化合物3a对MCF-7的抑制率为27.32%，对Bel-7402的抑制率为14.83%。3b对MCF-7的抑制率为29.15%，对Bel-7402的抑制率为22.06%。与阳性对照物顺铂相比，化合物3a，3b对MCF-7的抑制作用略高于顺铂，对Bel-7402的抑制作用低于顺铂。两个化合物均展现出了中等抑制活性(抑制率达到10%～80%为中等抑制活性)。3b对MCF-7和Bel-7402的抑制作用略高于3a，其在B环苯乙酸部分多了一个吸电子基团，说明B环吸电子基团的数量会对化合物的肿瘤细胞抑制活性产生影响。