双酚A(BPA)对单环刺螠急性毒性及消化酶活力的影响*

丁子媛，刘 顺，王思婕，陆 雯，亓 鲁，朱 龙，许星鸿

(江苏海洋大学 海洋科学与水产学院，江苏 连云港 222005)

双酚A(bisphenol A，BPA)属于环境内分泌干扰物，为制作环氧和酚醛树脂、聚碳酸酯塑料和食品漆涂料的基础原料[1]。BPA高度的生殖毒性和风险效应使得其被欧盟列为应引起高度重视的化合物之一。尽管BPA具有毒性，但它仍被广泛用于日常生活用品(包括纸张、水管、电子设备等)[2]，甚至出现在食品材料中(包括食品包装袋、饮用水瓶、罐头包装涂层等)[3]，对人类具有致癌、增加糖尿病和心脏病的风险等危害[4]。目前有关BPA毒性的研究多集中在哺乳类、两栖类和淡水水生生物等方面，如张石磊[5]发现低浓度BPA长期胁迫孕鼠导致其胚胎发育中断，二代小鼠生殖器官发育异常；李圆圆等[6]研究发现BPA对黑斑蛙(Pelophylaxnigromaculatus)胚胎的96 h-LC50为7.68 mg/L，对蝌蚪的96 h-LC50为9.00 mg/L；周家辉等[7]报道BPA暴露可延迟稀有鮈鲫(Gobiocyprisrarus)胚胎孵化，对仔鱼的毒性效应表现为死亡率升高、心包囊水肿、心率下降及鱼鳔充气率下降。BPA主要通过工业废水排放、垃圾渗滤液或其他化合物的自然降解进入水生态系统，进而对水生生物产生毒性作用，如抑制鱼类繁殖、干扰鱼类行为以及抑制藻类细胞分裂和光合作用等。BPA由于分布广、难降解、易蓄积，其对海洋底栖动物比陆生动物具有更高的毒性。

单环刺螠(Urechisunicinctus)俗称海肠，属于螠虫动物门(Echiura)、螠纲(Echiurida)、无管螠目(Xenopneusta)、刺螠科(Urechidae)、刺螠属(Urechis)，主要分布于中国、朝鲜、俄罗斯和日本等海域潮间带[8]。单环刺螠体壁肌肉味鲜美、富含蛋白质和不饱和脂肪酸，为消费者喜爱的海产品；其体腔液可提取纤溶酶、速激肽等药用活性物质[9]，具有较大的开发利用价值。有关BPA对单环刺螠的毒性效应迄今尚未见报道。本文研究了BPA对单环刺螠的急性毒性及消化酶活力的影响，旨在为环境内分泌干扰物对海洋底栖生物的毒性效应研究提供数据参考，并可为海洋生态系统中环境内分泌干扰物的风险评价和渔业生物资源保护提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用单环刺螠购自江苏省连云港市海宁中路水产品市场，平均体长为(11.5±1.3)cm，体质量为(19.8±3.5)g，于实验室暂养7 d后进行实验。暂养条件为：盐度25，pH 8，水温(15±1)℃，自然光照，连续充气，日投喂2次小球藻(Chlorellapacifica)，藻液密度1×106个/mL，投喂量10 mL/L。挑选体色鲜亮、大小均匀、活力较强的健康单环刺螠作为实验对象。实验用水为自来水和海水素配制成盐度25的人工海水，经过滤曝气充氧处理后使用。

1.2 试剂配制

因BPA在水中溶解度低，采用无水乙醇为助溶剂，配置成质量浓度为400 mg/L的母液，4 ℃避光保存。本研究所用BPA购自生工生物工程(上海)股份有限公司，为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 急性毒性实验 采用半静态水质接触法(GB/T 27861—2011)进行急性毒性实验[10]。根据BPA预实验得出96 h无死亡发生的最高浓度和导致100%死亡的最低浓度，两浓度间按照等对数间距设置7个质量浓度梯度：3.000，3.830，4.891，6.246，7.976，10.186和13.000 mg/L，另设海水空白组和无水乙醇溶剂组作为对照，溶剂组中无水乙醇含量与最高浓度组中无水乙醇含量相同。每组设置3个重复，每个重复随机放置10条单环刺螠，于17 cm×19 cm×30 cm养殖箱中饲养，养殖条件与暂养时相同，每24 h全量更换海水并维持各组BPA质量浓度，及时清除分泌物、排泄物以及死亡个体，实验期间不投饵，以消除饵料影响。实验共处理96 h，观察形态特征变化，并记录24，48，72和96 h的死亡个数。虫体颜色发白、用玻璃棒触碰时无明显收缩反应即为死亡[11]。采用概率单位法计算出不同暴露时间的死亡率、半致死浓度LC50以及安全浓度SC(safe concentration)。SC=96 h×LC50×0.1[12]。根据96 h的LC50评定污染物的毒性等级[13]。

1.3.2 BPA对单环刺螠消化酶活力的影响 根据“1.3.1”急性毒性实验所得BPA对单环刺螠的安全浓度以及BPA在水环境中的实际污染水平[1]，设置对照组和3个BPA浓度组：0.07，7，700 μg/L。每组设3个重复，每个重复随机放置20条单环刺螠，于17 cm×19 cm×30 cm养殖箱中饲养15 d，养殖条件与暂养时相同，每日全量更换海水并维持各组BPA质量浓度。在取材前一天停止投饵，以消除消化道内残饵的影响。于实验0.5，1，3，5，10和15 d，每组随机取3条单环刺螠，置冰盘内解剖，取出消化道，放掉呼吸肠中水分，以100 g/L加入预冷蒸馏水，于冰浴中匀浆10 min。取部分匀浆液直接用于测定脂肪酶活力，其余匀浆液于10 000 r/min，1 ℃离心30 min。取上清液于-80 ℃保存，用于测定其他消化酶活力。蛋白酶活力测定采用福林—酚法，淀粉酶活力测定采用淀粉—碘显色法，纤维素酶活力测定采用3，5-二硝基水杨酸显色法[14]，脂肪酶活力测定采用NaOH滴定法[15]。酶液蛋白浓度测定采用考马斯亮蓝G-250法，以牛血清蛋白为标准物进行测定。

蛋白酶活性单位定义为：在一定温度和pH下，1 min水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸作为1个酶活性单位(U)。淀粉酶活性单位定义为：在35 ℃下，30 min内，100 mL酶液中的淀粉酶能完全水解淀粉10 mg为1个酶活性单位(U)。纤维素酶活性单位定义为：在pH 4.4，65 ℃下，1 min催化纤维素生成1 μg葡萄糖为1个酶活性单位(U)。脂肪酶活性单位定义为：1 mL酶液在一定温度和pH条件下，1 min水解底物产生1 μmol的可滴定脂肪酸为1个酶活性单位(U)。各酶的活力均定义为：1 mg酶液蛋白所具有的酶活性单位数(U/mg)。

1.4 数据处理和评价方法

实验结果以“平均数±标准差”表示，利用SPSS 22.0统计软件进行单因子方差分析(One-Way ANOVA)，LSD(least significant difference)多重比较和Duncan氏检验，显著水平设为0.05；并得出BPA对单环刺螠急性毒性效应的概率单位与浓度对数的回归方程，以及48,72,96 h的LC50和95%置信区间。

2 结果

2.1 BPA对单环刺螠的急性毒性

单环刺螠接触不同浓度BPA后活力均受到一定影响，暴露24 h各处理组未出现死亡，但体形变细长、活力下降并伴有轻微吐脏现象。随暴露时间延长，单环刺螠体表粘液增多，体壁变薄、出现痤疮，褶皱增多呈串珠状；伸缩频率下降，受外界刺激时应激减弱；死亡个体多表现为黑色淤血、瘫软漂浮，或呈现红色肿胀、硬结下沉(见图1)。

a 体形细长或体表褶皱呈串珠状

暴露于不同浓度BPA后单环刺螠的死亡率结果见表1。无水乙醇溶剂组与海水空白组96 h内均无死亡，表明以无水乙醇作为助溶剂在个体水平对本实验的毒性结果无影响。24 h各浓度组未出现死亡现象，随着BPA浓度的升高和暴露时间的延长，单环刺螠死亡率逐渐上升，48 h高浓度组(质量浓度10.186 mg/L，13.000 mg/L)开始出现死亡，死亡率存在显著差异(P<0.05)，13.000 mg/L浓度组96 h全部死亡。

表1 暴露于不同浓度BPA溶液后单环刺螠的死亡率

BPA对单环刺螠急性毒性效应的回归统计结果见表2。在处理24 h内，各浓度组均未出现死亡，因此，24 h时BPA的LC50>13.000 mg/L。48，72，96 h时BPA的LC50(95%置信区间)分别为13.297 mg/L(12.455～14.993 mg/L)，10.487 mg/L(9.711～11.487 mg/L)，7.515 mg/L(7.000～8.098 mg/L)，BPA对单环刺螠的安全浓度SC为0.752 mg/L。根据BPA对单环刺螠急性毒性效应的概率单位与浓度对数的回归方程，48，72，96 h的相关系数R2分别为0.981 2，0.970 4，0.954 4，表明单环刺螠在BPA中的死亡率与质量浓度之间存在显著的相关性(P<0.05)，具有明显的剂量—效应关系。根据GB 30000.28—2013《化学品分类和标签规范 第28部分：对水生环境的危害》[13]对受试物的急性水环境毒性的分级标准(96 h的LC50≤1 mg/L为Ⅰ级，1 mg/L

表2 BPA对单环刺螠急性毒性效应的回归统计

2.2 BPA对单环刺螠消化道消化酶活力的影响

2.2.1 BPA对蛋白酶活力的影响 BPA对单环刺螠消化道胃蛋白酶活力的影响如图2所示。

图2 BPA对单环刺螠消化道胃蛋白酶活力的影响

在BPA暴露下，低质量浓度0.07 μg/L组胃蛋白酶活力呈现明显的诱导效应，处理0.5 d时升高至最大值(P<0.05)，但随胁迫时间延长逐渐下降，至处理15 d与对照组相近；中质量浓度7 μg/L组胃蛋白酶活力在BPA胁迫下虽略有上升，但与对照组差异不显著(P>0.05)；高质量浓度700 μg/L组胃蛋白酶活力呈现波动的变化，处理0.5 d时即显著低于对照组(P<0.05)，随暴露时间延长有所回升后又逐渐下降，整体呈现抑制效应。

BPA对单环刺螠消化道胰蛋白酶活力的影响如图3所示。

图3 BPA对单环刺螠消化道胰蛋白酶活力的影响

BPA暴露的一定时间内，对单环刺螠胰蛋白酶活力呈现显著的诱导效应。以高质量浓度700 μg/L组诱导最快，在处理0.5 d时胰蛋白酶活力即达到最大值，随后逐渐下降。0.07 μg/L和7 μg/L两组胰蛋白酶活力呈现先降后升再降的趋势，分别于处理5 d和1 d达到最大值。至处理15 d，实验组胰蛋白酶活力均显著低于对照组(P<0.05)，且呈现一定的剂量—效应关系。

2.2.2 BPA对单环刺螠消化道淀粉酶活力的影响 BPA胁迫对单环刺螠消化道淀粉酶活力呈现明显的抑制效应(见图4)。胁迫0.5 d和1 d时，0.07 μg/L和7 μg/L质量浓度组淀粉酶活力与对照组差异不显著，高质量浓度700 μg/L组淀粉酶活力显著低于其他实验组(P<0.05)。胁迫3 d时，各实验组淀粉酶活力均显著低于对照组，随胁迫时间延长虽略有回升，但至处理15 d，各实验组淀粉酶活力仍显著低于对照组(P<0.05)。

图4 BPA对单环刺螠消化道淀粉酶活力的影响

2.2.3 BPA对纤维素酶活力的影响 在BPA胁迫下，单环刺螠消化道纤维素酶活力呈现先降后升再降的变化趋势(见图5)。胁迫0.5 d和3 d，各实验组纤维素酶活力均持续下降，但实验组间差异不显著(P>0.05)。处理5 d时，实验组纤维素酶活力有所回升，但随后又呈现出下降趋势。至处理15 d时，各实验组纤维素酶活力均显著低于对照组(P<0.05)，胁迫浓度越高纤维素酶活力越低，呈现一定的剂量—效应关系。

图5 BPA对单环刺螠消化道纤维素酶活力的影响

2.2.4 BPA对脂肪酶活力的影响 由图6可见，BPA对单环刺螠消化道脂肪酶活力有显著诱导作用。处理0.5 d时，各实验组脂肪酶活力均显著升高，以中质量浓度7 μg/L组诱导幅度最大。随胁迫时间延长，各实验组脂肪酶活力均呈现先降后升再降的趋势，至处理10 d，低质量浓度0.07 μg/L组脂肪酶活力仍显著高于对照组，但至处理15 d，各实验组脂肪酶活力均显著低于对照组(P<0.05)。

图6 BPA对单环刺螠消化道脂肪酶活力的影响

3 讨论

3.1 BPA对单环刺螠的急性毒性

已有研究表明，BPA能对水生生物的生长发育产生毒性效应，导致畸形且行为异常等。李楠[16]报道高浓度BPA可导致斑马鱼(Barchydaniorerio)中毒，表现出侧游、沉底以及反应迟钝等中毒症状。牛海岗等[17]发现BPA使中国林蛙(Ranachensinensis)蝌蚪身体蜷缩、黏液增多、游泳速度减慢并失去平衡，高浓度BPA会导致林蛙蝌蚪死亡。本研究中，在BPA暴露下，单环刺螠体形变得细长、伸缩频繁，随着暴露时间延长，其活力降低，伸缩频率下降，受外界刺激时反应迟钝，身体僵硬，体表溃烂甚至瘫软死亡，与重金属镉[18]和盐度等胁迫[19]下单环刺螠的表现一致，属于外界环境变化时的机体应激反应。

单环刺螠的死亡率与BPA浓度呈正相关，并具有一定的时间—效应关系。24 h内各浓度组均未出现死亡，表明单环刺螠对短时间内较高浓度BPA暴露具有一定的耐受能力。但随暴露时间的延长，各实验组死亡率上升，96 h时13.000 mg/L质量浓度组单环刺螠全部死亡。BPA对单环刺螠48,72,96 h的LC50分别为13.297,10.487和7.515 mg/L，具有明显的剂量—效应关系。根据GB 30000.28—2013的分级标准，BPA对单环刺螠的毒性为Ⅱ级。BPA对日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)幼虾24,48 h的LC50分别为25.68,12.03 mg/L[20]；对稀有鮈鲫胚胎和仔鱼的96 h LC50分别为10.096,4.237 mg/L[7]；对明线瓶螺(Pomacealineata)成体48,96 h的LC50分别为22.80,11.09 mg/L[21]；对河蚬(Corbiculafluminea)96 h的LC50为6.34 mg/L[22]；对东亚三角涡虫(Dugesiajaponica)48,72 h的LC50分别为8.49,6.43 mg/L[23]。由此可见，单环刺螠对BPA的耐受能力高于河蚬和东亚三角涡虫，而低于明线瓶螺。关于BPA对海洋底栖动物的毒性效应研究文献非常有限，需要进一步积累该领域基础资料。

深圳市近海海域海水中BPA污染质量浓度在3.2～776.6 ng/L的范围内[24]，渤海南部海域与国内部分海域相比BPA质量浓度较低，范围为1.5～275 ng/L[25]，新加坡近海部分区域(如樟宜、实龙岗)BPA质量浓度达500 ng/L[26]。本研究结果表明BPA对单环刺螠的安全浓度为0.752 mg/L，虽远高于目前海水中所检测的BPA含量，但可通过食物链造成的富集效应对生物尤其是底栖动物带来一定的危害，其潜在的生态风险不可忽视。

3.2 BPA对单环刺螠消化道消化酶活力的影响

单环刺螠的生长发育依赖养分的摄入，与单环刺螠消化道中的消化酶密切相关。消化酶是具有促消化功能的蛋白质，参与机体能量转化，可分为蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶等，是评估毒理效应的有效参数[27]。因此，研究BPA对单环刺螠消化酶活力的影响，对人工养殖水质调控及海域水环境污染物危险评估具有重要意义。

在本研究中，短时间、低质量浓度的BPA胁迫可诱导单环刺螠蛋白酶和脂肪酶活力，但随胁迫时间延长和质量浓度增加，酶活力受到抑制。在内分泌干扰物PBDEs对褶皱臂尾轮虫(Brachionusplicatilis)消化酶的影响[28]、重金属(Cu2+,Zn2+)对日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)幼虾消化酶活力的影响[29]以及苯酚胁迫下多刺裸腹溞(Moinamacrocopa)肠道消化酶活力的变化[30]等研究中均得到了与本研究类似的“低促高抑”效应。这种“低促高抑”效应在早在19世纪就已被学者发现，又称Hormesis效应[31]。单环刺螠机体内环境稳态受低浓度BPA的干扰，启动应激反应，通过提高其消化酶活力能够供给较多的能量，以维持正常的生理代谢，但随着胁迫浓度的增大和胁迫时间的延长，超过了其耐受能力，消化酶活力亦受到抑制。

本研究结果显示BPA对淀粉酶和纤维素酶活力具有显著的抑制效应，与王书扬等[18]关于镉胁迫下单环刺螠体腔液淀粉酶的活力显著下降的报道相一致。毛姗姗[32]发现植物雌激素——金雀异黄素能显著降低金鱼(CarassiusauratusLinnaeus)肝脏及肠道淀粉酶、蛋白酶的活性。BPA被认为是一种类雌激素和内分泌干扰物，对斑马鱼胚胎发育具有生殖毒性[33]；BPA能通过损伤胰岛素信号通路、诱导代谢重编程、改变DNA甲基转移酶的表达、诱导组蛋白修饰并改变miRNA的表达等途径以及损伤抗氧化系统导致机体代谢紊乱[34]。Wang等[35]报道BPA对小鼠表现出强烈的肠道毒性，可引起肠道屏障功能障碍。单环刺螠为滤食性，以藻类和有机碎屑为食[36-37]，其食物富含植物多糖和纤维素，因此淀粉酶和纤维素酶活力处于较高水平。BPA胁迫可造成单环刺螠淀粉酶和纤维素酶活力迅速下降，表明BPA对其消化能力影响较大。关于BPA对单环刺螠消化机能影响的机制有待进一步研究。